澤瀉醇B 23-乙酸酯的肝保護作用及其藥理學機制.pdf

1、目的:研究澤瀉醇B23-乙酸酯(alisol B23-acetate，AB23A)的肝保護作用及其分子藥理學機制。
　　方法:(1)澤瀉醇B23-乙酸酯通過激活法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)促進小鼠部分肝切除后的肝再生作用。灌胃給予小鼠AB23A(12，5，25和50mg/kg)每日1次，連續(xù)7天。在第4、5、6、7天，行70％肝部分切除術或假手術。以肝臟比重、肝細胞增殖比率及有絲分裂指數(shù)評價AB

2、23A促肝再生作用;測定細胞周期蛋白Cyclin D1，Cyclin B1及其上游叉頭轉錄因子M1b(forkhead box M1b，F(xiàn)oxM1b)的基因和蛋白表達，揭示AB23A促肝細胞增殖作用機制;以血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)及肝內膽汁酸水平評價AB23A肝保護作用;測定膽汁酸合成限速酶Cyp7a1和膽汁酸外排轉運體Bsep表達變化，揭示AB23A降低肝內膽汁酸水平的作用機制;采用FXR拮抗劑木苦甾酮(gugg

3、ulsterone，GS)阻斷FXR信號通路，評價AB23A的體內促肝再生及肝保護作用是否與激活FXR有關;體外實驗采用小鼠原代肝細胞培養(yǎng)，測定AB23A對FXR靶基因的誘導作用，并采用基因沉默實驗測定FXR基因沉默對AB23A誘導FXR靶基因作用的影響;采用雙熒光素酶報告基因實驗評價AB23A對FXR的激活作用，以分子對接實驗模擬AB23A與FXR的結合作用。
　　(2)澤瀉醇B23-乙酸酯通過調控FXR介導的膽汁酸轉運體和合成

4、酶對ANIT所致小鼠肝損傷及膽汁淤積的保護作用。灌胃給予小鼠AB23A(10，20和40 mg/kg)每日1次，連續(xù)7天。在第5、6天給藥4小時后，灌胃給予ANIT(75 mg/kg)。以血清ALT、AST、堿性磷酸酶(ALP)，γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GTP），總膽紅素，總膽汁酸、肝內總膽汁酸、膽汁中總膽汁酸水平及肝組織病理學評價AB23A對ANIT所致肝損傷及膽汁淤積的保護作用;測定膽汁酸攝取轉運體Ntcp、Oatp1b2及外排轉運體

5、Bsep、Mrp2、Mdr2、Mrp3、Mrp4表達，揭示AB23A對肝內膽汁酸轉運的作用機制;測定膽汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1及膽汁酸結合酶Bal、Baat表達，揭示AB23A對膽汁酸合成及結合的作用機制;測定膽汁酸代謝酶Cyp3a11、Cyp2b10、Sult2a1及Ugt1a1表達，揭示AB23A對膽汁酸代謝的作用機制;采用FXR拮抗劑GS阻斷FXR信號通路，評價AB23A降低肝內膽汁酸及肝保護作用是否與

6、激活FXR有關;雙熒光素酶報告基因實驗體外評價AB23A對FXR的激活作用。
　　(3)澤瀉醇B23-乙酸酯通過激活FXR和STAT3對四氯化碳所致小鼠肝毒性的保護作用。以FXR激動劑CDCA為陽性對照藥，灌胃給予小鼠AB23A(10，20和40 mg/kg)每日1次，連續(xù)7天。在第5、6天給藥4小時后，腹腔注射給予CCl4(750μL/kg)。以血清ALT、AST、總膽汁酸、肝組織病理學及TUNEL細胞凋亡分析，評價AB23A對

7、CCl4所致小鼠肝毒性的保護作用;以BrdU染色陽性肝細胞數(shù)及有絲分裂指數(shù)評價AB23A對肝細胞增殖的影響;測定FoxM1b、Cyclin D1及CyclinB1表達，揭示AB23A促肝細胞增殖的作用機制;測定膽汁酸轉運體Ntcp、Bsep、Mrp2及膽汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1表達，揭示AB23A降低肝內膽汁酸水平的作用機制;測定p-STAT3及STAT3靶基因Bcl-xl、SOCS3表達，揭示AB23A減少凋亡肝細胞的作用

8、機制。
　　(4)澤瀉醇B23-乙酸酯作用于FXR介導的轉運體和酶對雌激素誘導小鼠膽汁淤積性肝損傷的保護作用。以FXR激動劑CDCA為陽性對照藥，灌胃給予小鼠AB23A(7.5，15和30 mg/kg)每日1次，連續(xù)7天。在第3天給藥4小時后，皮下注射給予10 mg/kg的17α-炔雌醇(EE)，每日1次，至第7天。以血清ALP、總膽汁酸、膽汁流、膽汁中膽汁酸水平及肝組織病理學評價AB23A對EE誘導膽汁淤積性肝損傷的保護作用;測

9、定肝內膽汁酸外排轉運體Bsep、Mrp2及攝取轉運體Ntcp表達，揭示AB23A對膽汁酸轉運的作用機制;測定膽汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1及上游轉錄因子Shp、Fgf15表達，揭示AB23A對膽汁酸合成的作用機制;測定膽汁酸代謝酶Cyp3a11、Cyp2b10、Sult2a1及Ugtla1表達，揭示AB23A對膽汁酸代謝的作用機制;采用FXR拮抗劑GS阻斷FXR信號通路，評價AB23A肝保護作用是否與激活FXR有關。
　　

10、結果:(1)在小鼠部分肝切除實驗中，AB23A通過上調肝細胞增殖相關蛋白FoxM1b，Cyclin D1和Cyclin B1表達，劑量依賴性地促進了小鼠肝細胞增殖;AB23A通過抑制膽汁酸合成限速酶Cyp7a1，誘導膽汁酸外排轉運體Bsep表達，降低了肝內膽汁酸水平、發(fā)揮出肝保護作用;AB23A對上述基因表達的影響、促肝再生及肝保護作用被FXR拮抗劑GS所阻斷;體外實驗表明AB23A對FXR靶基因的調控作用被FXR基因沉默所逆轉;雙熒光

11、素酶報告基因實驗和分子對接實驗進一步證實了AB23A對FXR的激活作用。
　　(2)在抗ANIT所致小鼠肝損傷及膽汁淤積實驗中，AB23A通過下調膽汁酸攝取轉運體Ntcp，上調外排轉運體Bsep、Mrp2及Mdr2表達，減少了肝臟對膽汁酸的攝取，增加了肝臟對膽汁酸的外排;通過抑制膽汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的表達，降低了肝內膽汁酸的合成，通過增加膽汁酸結合酶Bal和Baat的表達，增加了肝內膽汁酸的結合;通過誘導Ⅱ相代謝

12、酶Sult2a1的表達，增加了肝內膽汁酸的代謝。進一步通過體內和體外實驗方法證實AB23A對ANIT所致肝損傷和肝內膽汁淤積的肝保護作用是由于FXR介導的上述基因表達的調控。
　　(3)在抗CCl4所致肝毒性實驗中，AB23A通過調節(jié)參與肝細胞DNA復制及有絲分裂的重要基因FoxM1b、Cyclin D1及Cyclin B1的表達，促進了肝細胞的增殖;通過下調肝內膽汁酸攝取轉運體Ntcp和合成酶Cyp7a1、Cyp8b1的表達，上

13、調膽汁酸外排轉運體Bsep、Mrp2的表達，降低了肝內膽汁酸水平;此兩方面的作用與AB23A激活核受體FXR直接相關;通過誘導p-STAT3及STAT3靶基因Bcl-xl、SOCS3表達，減少了肝細胞的凋亡。
　　(4)在雌激素誘導膽汁淤積性肝損傷實驗中，AB23A通過上調外排轉運體Bsep和Mrp2，下調肝臟膽汁酸攝取轉運體Ntcp的表達，增加了肝臟對膽汁酸的外排，減少了肝臟對膽汁酸的攝取;通過抑制膽汁酸合成酶Cyp7a1和Cy

14、p8b1的表達，降低了肝內膽汁酸的合成;通過誘導Ⅱ相代謝酶Sult2a1的表達，增加了肝內膽汁酸的代謝。并進一步證實了AB23A對EE所致膽汁淤積性肝損傷的肝保護作用是由于FXR介導的上述基因表達的調控。
　　結論:AB23A通過激活FXR，促進了小鼠部分肝切除后的肝再生;通過調控FXR介導的膽汁酸轉運體和合成酶對ANIT所致肝損傷及膽汁淤積具有保護作用;通過激活FXR和STAT3對四氯化碳所致肝小鼠肝毒性發(fā)揮保護作用;通過作用于