膽堿和阿司匹林協(xié)同抗炎作用及其藥理學(xué)機制的研究.pdf

1、關(guān)節(jié)炎、膿毒癥、潰瘍性結(jié)腸炎、動脈粥樣硬化等一系列慢性進展性炎性疾病嚴重威脅人類健康。隨著世界人口老齡化等問題的凸顯，此類頑固性疾病的發(fā)病率也逐年升高，形勢非常嚴峻，這已經(jīng)成為非常令人關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。由于炎癥反應(yīng)涉及眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)的參與，目前針對此類疾病的治療仍然是一個非常棘手的問題。非甾體類抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）由于具有確切的鎮(zhèn)痛抗炎作用，一直

2、是各國推薦用于治療關(guān)節(jié)炎的一線用藥。但它們僅能改善炎癥癥狀，并不能延緩疾病的進展，而且嚴重的胃腸道副作用限制了其臨床應(yīng)用。更為不幸的是，目前所有的抗炎藥物用于治療膿毒癥這種失控性全身炎癥反應(yīng)的效果均被證明是無效的。因此，臨床上可用的抗炎藥物還遠遠不能滿足治療頑固性炎性疾病的需求，尋找新的抗炎靶點，研發(fā)更加安全有效的抗炎技術(shù)途徑具有重要的價值。
　　已經(jīng)公認，激活α7煙堿樣乙酰膽堿受體（α7受體）是治療一系列難治性炎癥疾病的重要策略

3、。因為采用藥理學(xué)途徑激活α7受體可以顯著抑制免疫細胞/內(nèi)皮細胞合成和釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素、和高遷移率族蛋白1(HMGB1)等促炎細胞因子。在“靶向α7受體抗炎通路”這一研究領(lǐng)域內(nèi)，膽堿是其中一個非常有發(fā)展前景的候選藥物。因為膽堿是天然的α7受體選擇性激動劑。同時，膽堿是機體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，是細胞膜卵磷脂和鞘磷脂的重要組成部分，是體內(nèi)合成乙酰膽堿的前體物質(zhì)和重要的甲基來源，口服安全無毒。有研究報道膽堿在不同的炎性疼痛

4、模型上具有鎮(zhèn)痛作用;在實驗性膿毒癥模型上也證實其具有保護作用;此作用與其激活α7受體有關(guān)。然而，膽堿對非感染性急性炎癥是否具有抗炎性腫脹作用還不清楚;膽堿對于膿毒癥的防治效果尚缺乏系統(tǒng)的研究。
　　以臨床上抗炎療效確切的藥物為基礎(chǔ)，采用藥物聯(lián)用的方案，是開發(fā)新的抗炎技術(shù)途徑的現(xiàn)實手段之一。阿司匹林是經(jīng)典的NSAIDs。雖然阿司匹林大劑量使用會導(dǎo)致胃腸道副作用，但小劑量的阿司匹林卻一直廣泛用于防治伴有炎癥和血液高凝狀態(tài)的心血管疾病病

5、人，而且業(yè)已證明其長期服用的有效性和安全性。值得關(guān)注的是，近年來的研究表明阿司匹林在抗炎方面比其他NSAIDs可能具有更多的治療學(xué)優(yōu)勢。一方面，阿司匹林可以通過環(huán)氧合酶依賴和非依賴的分子途徑發(fā)揮抗炎作用，表現(xiàn)在:(1)促進抗炎物質(zhì)Aspirin-triggered lipoxins(ATLs)的釋放，增加了巨噬細胞的吞噬功能;(2)對各種免疫細胞均具有免疫調(diào)節(jié)作用，有利于治療具有自身免疫反應(yīng)特點的疾病等。另一方面，高選擇性環(huán)氧合酶-2抑

6、制劑的抗炎效果非但并不優(yōu)于阿司匹林，而且有增加致死性心血管事件的風(fēng)險。因此，阿司匹林在NSAIDs中仍占有重要地位。尋找一種具有不同作用機制的抗炎藥物與阿司匹林聯(lián)用將有可能達到增強其抗炎療效，降低其使用劑量，從而降低劑量相關(guān)副作用的目的。由于膽堿可以通過激活α7受體抑制多種促炎細胞因子的釋放，而阿司匹林也具有多條抗炎分子途徑，理論上二者聯(lián)用能夠發(fā)揮更好的抗炎作用。有趣的是，本實驗室前期研究表明，在不同的炎性疼痛模型上，膽堿能增強低劑量的

7、阿司匹林的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。因此，我們推測膽堿與低劑量阿司匹林具有協(xié)同抗炎作用，這可能是一個更加安全有效的抗炎途徑。圍繞這一工作假設(shè)，本論文第一章在角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足趾腫脹模型上，以腫脹度為指標，評價了膽堿在急性非感染性局部炎癥反應(yīng)模型上的抗炎作用，并采用等輻射分析法研究了膽堿和阿司匹林聯(lián)用的交互作用類型及其與α7受體的關(guān)系。本論文第二章在LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型（全身失控性炎癥反應(yīng)模型）上，以生存時間和存活率為指標，系統(tǒng)研究了膽堿對全身炎

8、癥反應(yīng)/膿毒癥防治作用的最佳療效;研究了膽堿與阿司匹林聯(lián)用對膿毒癥小鼠的防治效果及其與α7受體的關(guān)系;并探討了二者聯(lián)用對細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放的影響。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.膽堿以及膽堿和阿司匹林聯(lián)用抑制λ-角叉菜膠所致足趾炎性腫脹的藥理學(xué)特征
　　小鼠足趾底部注射1％λ-角叉菜膠后1，2，3，4，5，和6h，足趾腫脹度(％，mean±S.E.M)分別為12.7±1.3％，17.5±1.5％，22.1±2.1

9、％，19.8±2.O％，17.2±1.8％，和16.0±2.2％。角叉菜膠注射后1～3h為急性炎性腫脹的發(fā)展期，4～6h為緩慢消退期，其中角叉菜膠注射后3h小鼠足趾腫脹達峰值。因此，選擇角叉菜膠注射后1～3h為主要觀測時間，并以3h這一時間點的腫脹度來計算藥物作用的ED50值。
　　阿司匹林11.25～200 mg/kg腹腔注射預(yù)防1h可以劑量依賴性抑制足趾腫脹的程度。在角叉菜膠注射后3h，以模型組的平均腫脹度為100％，則阿司匹

10、林11.25，22.5，45，100，和200 mg/kg給藥后的相對腫脹率分別為:94.6％，93.8％，72.0％，54.8％，和43.7％;ED50為136.73 mg/kg（95％可信區(qū)間:87.41～213.87）。
　　膽堿12.5～80 mg/kg腹腔注射預(yù)防3h也可以劑量依賴性抑制小鼠足趾炎性腫脹程度。在角叉菜膠注射后3h，以模型組的平均腫脹度為100％，則膽堿12.5，25，50，和80 mg/kg給藥后的相對腫

11、脹率分別為:91.1％，73.9％，70.5％，和66.9％; ED50為＞200.31mg/kg(95％可信區(qū)間:75.07～534.48)。
　　單獨給予膽堿12.5 mg/kg和阿司匹林11.25 mg/kg均無顯著的抗腫脹作用，但兩者聯(lián)用時可以顯著抑制足趾腫脹的程度，提示兩者可能具有協(xié)同作用。在兩藥聯(lián)用時的量-效關(guān)系研究中，我們根據(jù)等輻射分析法的原則，在維持兩藥這一固定劑量比例的條件下，采用劑量分別倍增/倍減的方式，設(shè)計了

12、如下5個劑量組，即膽堿3.125 mg/kg+阿司匹林2.8 mg/kg、膽堿6.25 mg/kg+阿司匹林5.625 mg/kg、膽堿12.5mg/kg+阿司匹林11.25mg/kg、膽堿25 mg/kg+阿司匹林22.5 mg/kg、和膽堿50 mg/kg+阿司匹林45 mg/kg。結(jié)果表明，兩藥聯(lián)用可以劑量依賴性抑制足趾腫脹的程度。以模型組的平均腫脹度為100％，聯(lián)合給藥各劑量組在角叉菜膠注射后3h小鼠的足趾相對腫脹度分別為83.

13、2％、71.5％、59.7％、46.3％、和34.7％，據(jù)此計算得到兩藥聯(lián)用時膽堿和阿司匹林的ED50分別為21.31 mg/kg(19.73～23.04)和19.19 mg/kg(17.76～20.73)。采用CalcuSyn2.0軟件分析得出膽堿和阿司匹林聯(lián)用的量-效曲線較分別單用時顯著左移，提示兩藥聯(lián)用既可以降低使用劑量，又可以提高抗炎效應(yīng)。膽堿和阿司匹林聯(lián)用時，在ED50，ED75，和ED90處的聯(lián)合用藥指數(shù)(Combinati

14、on index，CI)值分別為0.25，0.32，和0.44。由于CI值＜0.9為協(xié)同效應(yīng)，＜0.5為強協(xié)同效應(yīng)，因此判斷兩藥聯(lián)用具有很強的協(xié)同抗炎效應(yīng)。
　　選擇性α7受體拮抗劑MLA5 mg/kg腹腔注射預(yù)防給藥并不影響λ-角叉菜膠所致的足趾腫脹，但可以完全拮抗50 mg/kg的膽堿對足趾腫脹的抑制作用。MLA2 mg/kg可以拮抗膽堿12.5 mg/kg和阿司匹林11.25 mg/kg聯(lián)用時對足趾腫脹的協(xié)同抑制作用。這表明

15、單獨給予膽堿抑制炎性腫脹的機制主要由激活α7受體介導(dǎo);同時α7受體的激活參與了膽堿和阿司匹林的協(xié)同抗炎效應(yīng)。
　　2.膽堿以及膽堿和阿司匹林聯(lián)用對抗LPS誘導(dǎo)的膿毒癥的藥理學(xué)特征
　　50 mg/kg的LPS靜脈注射能成功建立失控性全身炎癥反應(yīng)（重度膿毒癥）小鼠模型，動物在24小時內(nèi)死亡率接近100％。單次預(yù)防給予膽堿10～50 mg/kg對膿毒癥小鼠生存時間和死亡率均無顯著影響;膽堿60，70，和80 mg/kg給藥后可顯

16、著延長小鼠的中位生存期，存活率分別為30％，20％，和20％;其中以膽堿60 mg/kg預(yù)防給藥效果最佳。
　　單次預(yù)防給予阿司匹林10和20 mg/kg對膿毒癥小鼠的生存曲線并無明顯影響;預(yù)防給予阿司匹林40和60 mg/kg后，膿毒癥小鼠的中位生存期顯著延長;阿司匹林10～60mg/kg預(yù)防給藥后，模型動物的存活率分別為0％，10％，10％，10％;提示阿司匹林僅能減輕炎癥反應(yīng)，延緩死亡，但在提高膿毒癥小鼠的存活率方面效果甚微

17、。當(dāng)阿司匹林的劑量高達100 mg/kg時，其保護作用則完全消失，與文獻報道一致。
　　單用阿司匹林20 mg/kg和單用膽堿40 mg/kg對膿毒癥小鼠均無顯著影響，但兩者聯(lián)用卻可以顯著提高存活率(60％)，利用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行統(tǒng)計分析表明，二者存在顯著的交互作用，提示兩藥預(yù)防聯(lián)用時具有協(xié)同增強效應(yīng)。
　　采用正交設(shè)計的方法得到膽堿治療膿毒癥的最佳方案為40 mg/kg間隔2h給藥3次，但存活率也僅能提高到30％

18、。而阿司匹林7.5～100 mg/kg單用治療的結(jié)果跟預(yù)防給藥的結(jié)果類似。雖然膽堿最佳治療方案和阿司匹林聯(lián)合用藥治療膿毒癥小鼠時并未發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用，但在存活率方面，兩藥聯(lián)用均高于單用，提示兩藥聯(lián)用治療膿毒癥時有疊加作用。
　　預(yù)防給予2 mg/kg MLA本身并不影響模型小鼠的生存時間和存活率，但可以完全阻斷60 mg/kg膽堿對模型小鼠的保護作用，說明膽堿對膿毒癥小鼠的治療作用是通過激活α7受體介導(dǎo)的。2 mg/kg MLA可以拮

19、抗膽堿40 mg/kg和阿司匹林20 mg/kg聯(lián)用的抗膿毒癥效果，證明α7受體的激活參與了兩藥的協(xié)同保護作用。
　　文獻報道，無論是角叉菜膠還是LPS所致的炎癥反應(yīng)，在病理生理機制上均歸咎于促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的大量釋放。因此，我們研究了膽堿40 mg/kg和阿司匹林20mg/kg單用或聯(lián)用對LPS所致全身炎癥反應(yīng)小鼠血清細胞因子和炎癥介質(zhì)的影響。膽堿40 mg/kg可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的血中TNF-α、IL-1β、IL-6

20、、HMGB1、TXA2、 PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影響IFN-γ和抗炎細胞因子IL-10的含量。而阿司匹林20 mg/kg可以顯著抑制IL-1β、IL-6、IL-10、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影響IFN-γ、TNF-α和HMGB1的含量。值得注意的是，兩者聯(lián)用時可以顯著抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1、TXA2、PGI2、 LTB4、和PGE2的病理性

21、增高。兩藥聯(lián)用較分別單用可以更有效地抑制IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1和PGE2的釋放，表明膽堿和阿司匹林聯(lián)用時能更好地抑制LPS所致促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，更有效地控制機體的過度炎癥反應(yīng)。
　　在離體培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞上，我們進一步探討了如下兩個問題:(1)阿司匹林是否增強膽堿對細胞因子TNF-α的抑制作用;(2)膽堿是否增強阿司匹林對花生四烯酸代謝的抑制作用。
　　LPS(100

22、 ng/ml)刺激培養(yǎng)的RAW264.7細胞可致上清液中TNF-α的含量顯著升高，膽堿(1～50 mmol/L)可以劑量依賴性抑制TNF-α的釋放，與文獻報道一致;但100μmol/L的阿司匹林與50 mmol/L的膽堿聯(lián)用時卻并不增強膽堿對TNF-α的抑制作用，提示兩藥聯(lián)用的機制可能不是通過抑制TNF-α這一分子途徑。
　　LPS（1μg/ml）刺激培養(yǎng)的RAW264.7細胞可導(dǎo)致上清液中TXA2和PGI2的顯著升高，阿司匹林(

23、0.1～30μmol/L)可以劑量依賴性抑制TXA2和PGI2的釋放;但膽堿(0.1～10 mmol/L)并不影響TXA2和PGI2的含量;而且1mmol/L膽堿和阿司匹林聯(lián)用并不影響阿司匹林對TXA2和PGI2釋放的抑制作用。這提示膽堿并不直接抑制環(huán)氧合酶的活性，也不增強阿司匹林對環(huán)氧合酶活性的抑制作用。
　　由于阿司匹林的抗血小板作用源于其對TXA2的抑制作用而阿司匹林的胃腸道副作用源于其對PGI2的抑制作用，而膽堿本身并不直

24、接影響TXA2和PGI2的代謝，也不影響阿司匹林對TXA2和PGI2的抑制作用，提示兩藥聯(lián)用的情況下，膽堿在提高阿司匹林的抗炎效果和降低使用劑量的同時，既不會增加阿司匹林所致的胃腸道副作用也不會增加出血傾向，表明膽堿和低劑量阿司匹林聯(lián)用是更為安全有效的抗炎技術(shù)途徑。
　　綜上所述，本研究得出如下結(jié)論:
　　1.膽堿通過激活α7受體對局部和全身炎癥反應(yīng)發(fā)揮顯著的抗炎作用。
　　2.膽堿和低劑量阿司匹林聯(lián)用具有協(xié)同抗炎作用