膽堿對缺血性腦血管新生的影響及其藥理學機制研究.pdf

1、1.動物實驗分組與給藥方法
　　背景：
　　腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點。缺血性腦卒中占腦卒中絕大多數，所占比例約87％。腦卒中是全球60歲以上人口第二位死亡原因和15～59歲人口第五位死亡原因，在我國腦卒中已經成為城市第三位和農村人口第二位死亡原因。目前我國腦卒中患者約750萬，其中450萬致殘，喪失勞動能力或基本生活自理能力；每年新發(fā)病例250萬，我國缺血性腦卒中發(fā)病率仍以每年8.7%的速率上升。腦卒中嚴

2、重危害人類健康，造成患者及其家庭和國家嚴重的醫(yī)療、經濟和社會負擔，我國每年腦卒中造成的經濟損失高達400億元，是其他心血管疾病的10倍。
　　缺血性腦卒中的發(fā)病機制極其復雜，與能量耗竭、氧化應激、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮（NO）、鈣超載、細胞凋亡、炎癥等密切相關。缺血性腦卒中臨床治療方法是溶栓，美國FDA批準的唯一溶栓藥物是組織纖溶酶原激活劑（ tissue plasminogen activator, tPA），治療時間

3、窗僅為腦卒中發(fā)病后4.5小時，因此絕大多數患者得不到有效救治。幾十年來全球醫(yī)生和科學家們一直致力于神經保護藥物的研究，雖然這些藥物在實驗室研究中取得了巨大進展，但是在后期的臨床試驗中都失敗了。尋找治療缺血性腦卒中的新策略和新藥物是腦卒中研究的熱點和難點。
　　缺血性腦卒中發(fā)生時，缺血缺氧可促進機體發(fā)生代償性血管新生，但過程緩慢，作用很弱。通過給予藥物促進腦缺血局部血管新生，建立新的循環(huán)通路以有效緩解缺血引起的神經損傷，并對神經再生

4、及神經功能恢復產生治療作用，這種方法就是治療性血管新生，治療性血管新生有望成為臨床治療缺血性腦卒中的新策略。我室前期研究報道血管內皮細胞存在α7 nAChR，參與血管新生調節(jié)，其激動劑膽堿，能夠增加內皮細胞胞內Ca2+濃度，促進內皮細胞增殖及體外血管索形成，促進心梗組織側枝循環(huán)的建立。提出α7 nAChR可能是治療心腦血管缺血性疾病的新靶標。膽堿是否可以促進腦血管新生從而提供腦保護以治療缺血性腦卒中有待研究。本研究以永久性局灶性腦缺血大

5、鼠和低氧誘導下大鼠腦微血管內皮細胞為研究對象，觀察膽堿對缺血性腦卒中的治療作用及其血管新生相關機制。
　　方法：
　　雄性SD大鼠（體重280±20g）隨機分為8組，每組18只，包括假手術組、膽堿50 mg/kg組、膽堿100 mg/kg組、膽堿200 mg/kg組、膽堿100 mg/kg+α7 nAChR選擇性阻斷劑MLA1 mg/kg組、MLA1 mg/kg組和陽性對照藥尼莫地平20 mg/kg組。模型組和各給藥組大鼠采

6、用線栓法誘導右側大腦中動脈永久性局灶性腦缺血，假手術組僅做血管分離，不插管，其余操作同手術組。所有藥物用注射用水溶解，膽堿和尼莫地平口服給藥，MLA采用皮下給藥，給藥量2 mL/kg，于手術后4 h給藥，以后每天一次，連續(xù)給藥10天。
　　2.動物實驗檢測指標
　　測定144只大鼠10天的生存率和體重；應用Bederson評分評估神經功能缺損；應用雙前肢抓握實驗和平衡木實驗測定大鼠的行為學能力；pMCAO后10 d大鼠麻醉處

7、死后迅速取腦，大腦冠狀位切片應用 TTC染色測定腦梗死體積；梗死側大腦拍照后測定腦表面血管長度和面積用于觀察缺血腦表面血管新生情況；腦石蠟切片HE染色觀察病理形態(tài)學改變；切片經CD34免疫組化及CD34/PCNA免疫熒光染色觀察大鼠缺血腦皮質微血管新生情況；測定血清NO和VEGF水平；Real-time PCR和Western blot檢測缺血腦皮質α7 nAChR，HIF-1α，eNOS，iNOS和VEGF基因轉錄和蛋白表達水平。

8、r>　　3.大鼠腦微血管內皮細胞的培養(yǎng)和鑒定
　　取3周齡大鼠腦用改良膠原酶/分散酶消化法培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內皮細胞。簡單的說，將2～3周齡大鼠腦皮質剪碎、勻漿，然后先后通過200μm和77μm的濾網過濾，濾網上組織應用0.1%膠原酶/分散酶37℃消化25 min，沉淀中加入25% BSA-DMEM中1000×g，梯度離心20 min分離微血管層。分離的微血管加入完全DMEM培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)于5% CO2培養(yǎng)箱中，完全培養(yǎng)基成

9、分包括：20% FBS，100μg/mL內皮細胞生長因子，100μg/mL肝素鈉，3.75 mg/mL HEPS，0.2 U/mL胰島素，0.3 mg/mL L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，pH7.2–7.4。細胞應用CD34抗體免疫細胞化學法鑒定陽性，第三代細胞用于實驗研究。
　　4.細胞實驗檢測指標
　　在低氧（1%O2、95%CO2）培養(yǎng)條件下，運用小干擾RNA技術（small-inter

10、fering-RNA， siRNA）沉默 HIF-1α基因，應用 MTS試劑盒檢測膽堿對腦微血管內皮細胞的增殖作用；應用劃痕實驗檢測膽堿對腦微血管內皮細胞的遷移作用；應用Matrigel基質膠使內皮細胞形成血管索，檢測膽堿對腦微血管內皮細胞的成管作用影響；應用NO生化試劑盒和VEGF ELISA試劑盒檢測細胞上清液NO和VEGF水平。細胞實驗分組：對照組（無膽堿DMEM）；膽堿1μM組；膽堿10μM組；膽堿100μM；膽堿100μM+M

11、LA1μM組；MLA1μM組；膽堿10μM+HIF-1αsiRNA100 nmol/L組。
　　5.統(tǒng)計學方法
　　所有數據用均數±標準差（mean±SD）表示，統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，各組均數間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni’s檢驗，P＜0.05作為差異有顯著性。
　　結果：
　　第一部分膽堿對大鼠局灶性腦缺血的治療作用及其血管新生機

12、制
　　1.膽堿增加pMCAO大鼠生存率，改善體重和神經功能
　　大鼠pMCAO后10天，與假手術組相比，大鼠生存率降到60%。膽堿50～200 mg/kg給藥10天，提高生存率到67%～80%，但是α7 nAChR選擇性阻斷劑MLA1 mg/kg能夠阻斷膽堿100 mg/kg的作用。大鼠pMCAO后10天，體重明顯減輕，給予膽堿治療后體重明顯增加。應用Bederson評分連續(xù)10天評定大鼠神經功能缺損，模型組Bederso

13、n評分顯著增加，100和200 mg/kg膽堿給藥7～10天明顯改善神經功能缺損；應用雙側前肢抓握和平衡木行走實驗評定大鼠前肢肌力和感覺運動反射和協(xié)調能力，膽堿治療可以劑量依賴性提高大鼠肌力，但是膽堿對大鼠平衡木行走實驗評分沒有顯著改變；膽堿的這些作用能夠被MLA所阻斷。
　　2.膽堿減少pMCAO大鼠腦梗死體積和神經細胞死亡
　　大鼠pMCAO后10天，腦梗死體積明顯增加；膽堿治療10天，能夠劑量依賴性降低腦梗死體積；但是

14、膽堿的作用能夠被MLA所完全阻斷；在腦切片HE染色圖像中，模型組大鼠可見許多死亡的神經細胞，同時伴有核固縮、腫脹和空泡化；膽堿能夠顯著改善這些病理學改變；MLA能夠阻斷膽堿的作用。
　　3.膽堿促進缺血腦組織血管新生
　　大鼠pMCAO后10天，檢測膽堿對腦缺血表面和腦缺血組織半影區(qū)血管新生情況。與假手術組相比，模型組腦表面血管數量明顯增加，膽堿能夠劑量依賴性地促進pMCAO大鼠腦缺血組織血管新生，總的血管長度和血管面積與模

15、型組相比顯著性增加。CD34/PCNA免疫熒光雙染顯示新增殖的血管內皮細胞，代表微血管密度。與模型組相比，膽堿100 mg/kg和200 mg/kg組CD34和PCNA共表達細胞數明顯增加。MLA能夠完全阻斷膽堿對pMCAO大鼠缺血腦組織促血管新生作用。CD34免疫組化結果與之一致。尼莫地平和膽堿作用不一致，不能夠促進缺血腦組織血管新生。
　　4.膽堿提高pMCAO大鼠血清NO和VEGF水平
　　pMCAO后10天，測定大鼠

16、血清NO和VEGF水平。與假手術組比較，模型組血清NO水平明顯降低，但是VEGF水平沒有明顯改變。100～200 mg/kg膽堿給藥10天均能顯著增加血清NO和VEGF的水平，這一作用能夠被MLA所阻斷。尼莫地平增加NO水平，但對VEGF水平沒有明顯影響。
　　5.膽堿對pMCAO大鼠缺血腦皮質相關基因和蛋白的影響
　　大鼠pMCAO后10天，應用Real-time PCR和Western blot檢測缺血腦皮質相關基因和蛋

17、白表達水平。與假手術組相比，模型組α7 nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA水平明顯上調，然而eNOS mRNA顯著下調，iNOS mRNA沒有明顯改變。100 mg/kg治療10天顯著增加α7 nAChR、HIF-1α、eNOS和VEGF mRNA水平，但是對iNOS基因沒有明顯改變。1 mg/kg MLA能夠阻斷膽堿的上述作用，但是其本身沒有直接作用。各組α7 nAChR、HIF-1α、eNOS、iNOS和VEGF蛋白表達水

18、平結果與基因表達結果基本上一致。
　　第二部分膽堿對低氧條件下rBMECs的影響
　　1.膽堿促進rBMECs增殖、遷移和小管形成
　　在1%的低氧條件下孵育24 h，與對照組相比，1～100μM膽堿能夠濃度依賴性地促進rBMECs增殖，細胞遷移和血管索形成；1μM MLA和100 nmol/L HIF-1αsiRNA能夠阻斷10μM膽堿的上述作用，并且不產生直接作用，提示膽堿是通過激活α7 nAChR上調HIF-1α

19、表達促進rBMECs增殖、遷移和小管形成。
　　2.膽堿增加rBMECs培養(yǎng)液中NO和VEGF水平
　　低氧條件下，給藥24 h后測定rBMECs培養(yǎng)上清液中NO和VEGF水平。與對照組相比，1～100μM膽堿能夠濃度依賴性地提高NO和VEGF水平。MLA能夠阻斷膽堿促rBMECs分泌NO和VEGF；HIF-1α siRNA能夠阻斷膽堿促rBMECs分泌VEGF但是對NO分泌無明顯影響。提示膽堿促進rBMECs分泌VEGF與

20、激活α7 nAChR和HIF-1α同時相關；而促進NO分泌僅與激活α7 nAChR相關。
　　結論：
　　1.膽堿通過激活α7 nAChR促進pMCAO大鼠缺血腦組織血管新生，形成側枝循環(huán)，從而提高大鼠生存率，減少腦梗死體積，改善體重和神經行為學功能。
　　2.膽堿治療大鼠缺血性腦卒中的血管新生作用與上調腦組織α7 nAChR，HIF-1α，eNOS和VEGF mRNA和蛋白表達，提高血清VEGF和NO水平有關。