MAGE-3原核表達載體pET30a(+)-MAGE-3的構建和表達.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文MAGE-3原核表達載體pET30a(+)-MAGE-3的構建和表達姓名：付慶申請學位級別：碩士專業(yè)：免疫學指導教師：趙國強;王中全20040513鄭州大學碩士學位論文 M A G E ．3 原核表達載體的構建和表達p E T 3 0 a ( + ) 同時用X h oI 酶切，電泳膠回收純化后對線性載體p E T 3 0 a ( + ) 進行去磷酸化處理，將線性載體與目的基因連接，轉化B L 2 1 ( D E 3

2、) ，篩選出陽性菌落，通過引物T 7 ／M P 2 鑒定出陽性克隆( 正插重組子) ，并進行D N A 測序；轉化菌經I P T G誘導表達，并經1 2 ％S D S ．P A G E 凝膠電泳，考馬斯亮藍染色及W e s t e r n b l o t 鑒定表達情況。結果：1 ．靶基因擴增及酶切鑒定：通過R T - P C R 擴增得到約O ．9 5 k bM A G E 一3 全長編碼序列，并分別經H i n dI I I S HE

3、 c o R I 酶切鑒定，結果與預期相符。2 ．克隆和亞克隆重組子結果鑒定：靶基因與p G E M —T E a s y 質粒連接后，轉化J M l 0 9 ，藍白篩選后隨機選擇6 個陽性菌落以T 7 ／S P 6 作為引物進行P C R 擴增，均得到長于約為1 ．1 k b 的擴增片段，均為陽性克隆。將去磷酸化的p E T 3 0 a ( + ) 雙粘質粒與雙粘靶片段M _ A G E 一3 連接，轉化B L 2 1 ( D E 3

4、 ) ，對9 個陽性克隆進行以T 7 ／M P 2 為引物的P C R 擴增，有三個菌落的擴增產物大小約為1 ．2 k b ，為陽性克隆( 正插重組子) 。對陽性克隆進行D N A 測序證實，我們所克?。瘉喛寺〕龅腗 A G E ．3 基因片段的堿基組成與G e n B a n k 公布的M A G E ．3 N M 0 0 5 3 6 2 基因序列完全一致。3 ．p E T 3 0 a ( + ) ．M A G E ．3 在B L 2

5、 1 ( D E 3 ) 中表達：轉化菌經I P T G 誘導表達，并經1 2 ％S D S —P A G E 凝膠電泳，考馬斯亮藍染色及W e s t e r n b l o t 鑒定，證明了M A G E ．3蛋白的成功表達。結論：本實驗利用分子生物學方法，成功構建了原核表達載體p E T 3 0 a ( + ) - M A G E - 3 ，并誘導其在宿主菌內的成功表達。通過此項研究，得到了M A G E 一3 全蛋白抗原，為以M