臨床相關(guān)毛孢子菌體外藥物敏感性及分子生物學(xué)鑒定方法研究.pdf

1、[目的]探討臨床相關(guān)毛孢子菌對(duì)5種常見抗真菌藥物的體外敏感性；研究聯(lián)合應(yīng)用PCR—反向線點(diǎn)雜交技術(shù)鑒定臨床常見毛孢子菌。 [方法]首先對(duì)48株毛孢子菌通過形態(tài)學(xué)、API20C AUX、Vitek2 Compact進(jìn)行初步鑒定，然后測(cè)序核糖體rDNA ITS、28S D1—D2區(qū)準(zhǔn)確鑒定到種；對(duì)36株阿薩希毛孢子菌核糖體rDNA28S和5S之間的IGS1區(qū)進(jìn)行測(cè)序并基因分型，作分子流行病學(xué)分析；采用濃度梯度法(E-Test)測(cè)定氟

2、康唑、伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B及卡泊芬凈對(duì)48株毛孢子菌的最低抑菌濃度(MIC)；基于不同種毛孢子菌rDNA ITS或D1—D2區(qū)序列多形性設(shè)計(jì)種特異性探針，評(píng)價(jià)反向線點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)常見毛孢子菌的區(qū)分能力。 [結(jié)果]形態(tài)學(xué)方法不能準(zhǔn)確區(qū)分不同種的毛孢子菌，生化鑒定法，如API20C AUX或Vitek2 Compact只能鑒定阿薩希毛孢子菌、粘質(zhì)毛孢子菌及皮瘤毛孢子菌，對(duì)這3種之外的其他毛孢子菌無法鑒定。聯(lián)合應(yīng)用核糖體rDN

3、A ITS及D1—D2區(qū)序列分析將48株毛孢子菌鑒定為8個(gè)種：36株阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、1株皮瘤毛孢子菌(T．inkin)、1株真皮毛孢子菌(T．dermatis)、1株皮膚毛孢子菌(T．cutaneum)、1株賴巴克毛孢子菌(T．laibachii)、2株T．japonicum、4株T． domesticum和2株T．jirovecii。IGS1區(qū)序列分析結(jié)果顯示35株阿薩希毛孢子菌(菌株P(guān)UMC

4、H30418沒參加分析)共有四種基因型，分別為genotype1，3，4，6，所占比例分別為28.6％、20％、48.5％、2.9％；報(bào)道稱日本菌株主要為genotype1，美國(guó)菌株為genotype3或5。體外藥敏結(jié)果顯示：氟康唑和兩性霉素B對(duì)阿薩希毛孢子菌活性很差：MIC50分別為24μg/mL和2μg/mL，MIC90分別為256μg/mL和64μg/mL；除一株真皮毛孢子菌(T．dermatis)對(duì)伏立康唑有較高M(jìn)IC值外，伏立

5、康唑和伊曲康唑?qū)Σ煌N毛孢子菌有很好的體外活性；新型抗真菌藥卡泊芬凈對(duì)毛孢子菌幾乎無體外活性，除一株皮膚毛孢子菌(T．cutaneum)外，其他47株毛孢子菌MIC>32μg/mL。反向線點(diǎn)雜交的結(jié)果：通過對(duì)8種毛孢子菌核糖體rDNA ITS及D1—D2區(qū)序列多形性分析，共設(shè)計(jì)了34個(gè)種特異性探針；所有探針具有相同的參數(shù)，長(zhǎng)度18—30bp，Tm值58—65℃，二級(jí)結(jié)構(gòu)不超過中級(jí)，不形成二聚體等；從DNA提取到反向線點(diǎn)雜交結(jié)果觀察歷時(shí)1

6、0多個(gè)小時(shí)，以測(cè)序鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，反向線點(diǎn)雜交技術(shù)成功地將8種毛孢子菌區(qū)分開來。 [結(jié)論]形態(tài)學(xué)方法不論是菌落形態(tài)還是顯微鏡下特點(diǎn)都不足以區(qū)分不同種的毛孢子菌；生化鑒定法常常對(duì)少見真菌無能為力，本研究中API20C AUX或Vitek2Compact只能鑒定阿薩希毛孢子菌、粘質(zhì)毛孢子菌及皮瘤毛孢子菌；DNA序列分析，特別是聯(lián)合核糖體rDNA ITS及D1—D2區(qū)序列分析可快速準(zhǔn)確地區(qū)分不同種毛孢子菌；反向線點(diǎn)雜交技術(shù)基于rDNA

7、 ITS及D1—D2區(qū)序列多形性設(shè)計(jì)種特異性探針，經(jīng)簡(jiǎn)單的反向線點(diǎn)雜交步驟成功地將8種毛孢子菌鑒定開來，是一種耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、特異性良好的分子生物學(xué)鑒定及診斷方法；毛孢子菌對(duì)5種常見抗真菌藥物的敏感性不同于常見酵母菌，且不同種毛孢子菌之間的敏感性也有很大差異。本研究與文獻(xiàn)中的結(jié)論相同，兩性霉素B和氟康唑?qū)Π⑺_希毛孢子菌的體外活性較差，卡泊芬凈對(duì)毛孢子菌沒有體外抗菌活性；三唑類抗真菌藥物伏立康唑和伊曲康唑?qū)γ咦泳捏w外敏感性最好。