2013年感染人H10N8亞型AIV的起源及反向遺傳系統(tǒng)的建立.pdf

1、禽流感病毒(AIV)屬正粘病毒科，單股負鏈的RNA病毒。近年來，不斷出現禽流感病毒感染人的新亞型。目前可感染人的AIV包括H5N1、H6N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7和 H10N8，其中 H10N8、H7N9、H6N1是2013年首次發(fā)現的可感染人的AIV亞型。禽流感病毒（AIV）在世界范圍內尤其在亞洲廣泛流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失，同時對人類的公共衛(wèi)生安全也產生了一定的威脅。1965年利H1

2、0N8亞型AIV首次在意大利的鵪鶉體內被分離到，中國第一次分離到H10N8亞型AIV是在2007年洞庭湖水樣調查中，在2012年在廣東省的鴨體內同樣分離到了該病毒。2013年12月中國江西省發(fā)生了首例H10N8亞型禽流感病毒感染人的病例，在此之前H10N8亞型禽流感的遺傳背景還不清晰。為此本實驗室進行了相關研究。
　　2013年12月本實驗室在感染 H10N8的患者及活禽交易市場分離了三株H10N8禽流感病毒株，分別是A/Jian

3、gxi-Donghu/346-1、A/Jiangxi-Donghu/346-2和A/chicken/Jiangxi/102/2013。本研究對這三個病毒株進行了遺傳演化分析，推測了該病毒的起源，H10和N8首先在野鳥中發(fā)生重組，因為病毒的H10和N8都在鴨子當中分離到，所以最有可能是在野鴨中發(fā)生重組，繼而在雞體內與H9N2亞型流感病毒發(fā)生重組，并且通過重組獲得了 H9N2的內部基因。研究發(fā)現A/Jiangxi-Donghu/346-1、

4、A/Jiangxi-Donghu/346-2和 A/chicken/Jiangxi/102/2013三株病毒的HA、NA、PA、NP、M和NS基因具有相同的來源，且這三株毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS均來自雞H9N2亞型禽流感病毒。流感病毒根據NA序列的不同可分為N1型和N2型，N1型包括N1、N4、N5和N8，N2型包括N2、N3、N6、N7和 N9。本研究的N8屬于N1型流感病毒，N1型流感病毒對奧司他韋的耐藥突變通常在第

5、275位發(fā)生由H到K的變化，對N1型流感病毒來講在292位的耐藥突變出現的情況比較少。同時本研究發(fā)現，在經奧司他韋治療4天后，H10N8毒株NA片段第292位出現由R到K的耐藥突變。
　　反向遺傳技術是相對于經典遺傳技術而言的，就是對生物體從基因水平上進行操作，然后確定對生物體表型和性狀的影響。病毒的反向遺傳技術，通常被稱為病毒拯救，是通過構建RNA病毒的感染性分析克隆，在DNA分子水平上對其進行體外操作，從而研究病毒結構與功能的

6、方法。本研究利用 RT-PCR擴增RNA病毒基因組的cDNA片段，然后利用利用限制性內切酶的酶切位點，將其克隆于pHW2000載體，獲得基因組全長cDNA克隆，將其轉染至293T細胞，全基因組 cDNA在細胞內轉錄、復制并產生病毒的所有組分，最后包裝成具有感染性的病毒離子。本研究成功建立H10N8亞型禽流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)，拯救出帶有遺傳標記的H10N8亞型禽流感毒株r346-1、r346-2和r102，并在SPF雞胚中5代，測定重組