動(dòng)物RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)的研究和建立.pdf

1、針對(duì)非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒發(fā)展起來的病毒反向遺傳學(xué)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能、復(fù)制與表達(dá)、病毒致病機(jī)制等研究.本研究用T7 RNA聚合酶系統(tǒng)和聚合酶I系統(tǒng)為基礎(chǔ)建立了體內(nèi)外拯救方法并初步進(jìn)行應(yīng)用. 一、SVDV HK/70株生物特性測(cè)定、生物信息學(xué)分析及以T7 RNAP為基礎(chǔ)的體外病毒拯救方法的建立和應(yīng)用為了建立以T7 RNA聚合酶系統(tǒng)為基礎(chǔ)的體外拯救病毒方法,選擇豬水泡病病毒(SVDV)HK/70株作為細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的RNA

2、病毒的研究模型.首先,分離和鑒定了該病毒,并測(cè)定了該病的一些生物學(xué)特性.然后,構(gòu)建了SVDV全長(zhǎng)cDNA并進(jìn)行序列測(cè)定,以此為基礎(chǔ),分析了其相關(guān)生物信息學(xué)特征.為了鑒定SVDV HK/70株的全長(zhǎng)cDNA分子的感染性,以線化的SVDV HK/70株的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒(pSVOK<,12>)為模板,應(yīng)用T7 RNA聚合酶系統(tǒng)在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,將獲得的RNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入IBRS-2細(xì)胞,傳代培養(yǎng),可以觀察到典型的SVDV致細(xì)胞病變效應(yīng).

3、使用反向血凝鑒定試驗(yàn)、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和序列測(cè)定進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,從豬水泡病病毒全長(zhǎng)eDNA拯救出了豬水泡病病毒(G-SVDV);利用常規(guī)負(fù)染的方法,電鏡觀察了G-SVDV的形態(tài):測(cè)定了G-SVDV的TCID<,580>和LD<,50>,并與親本毒進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示G-SVDV與親本毒的毒力差別不顯著.本研究結(jié)果證明,我們已經(jīng)成功構(gòu)建了豬SVDV HK/70的感染性cDNA克隆,為進(jìn)一步探索SVDV病毒致病的分子機(jī)制及

4、研制新型SVD疫苗奠定了良好的基礎(chǔ). 二、以T7 RNAP為基礎(chǔ)的體內(nèi)病毒拯救方法的建立和應(yīng)用為了建立高效的體內(nèi)病毒拯救系統(tǒng),我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)建立了穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系.先克隆出T7 RNAP基因,定向克隆進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABEpuro,得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pT7BABEpuro.共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞,獲得含有VSV-G膜的假型病毒,含有T7 RNA聚合酶基因.然后把該假型病毒感染靶細(xì)胞,把T7 RNAP基因分

5、別整合進(jìn)BHK-21、IBRS-2和SK6細(xì)胞的基因組內(nèi).通過抗性篩選,獲得了穩(wěn)定表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄活性T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系,通過PCR、間接免疫熒光和流式細(xì)胞儀(FCM)等技術(shù)進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明,該T7 RNAP能夠被穩(wěn)定地整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組內(nèi),細(xì)胞系內(nèi)的T7 RNAP具有較好的轉(zhuǎn)錄活性,其活性傳代不減弱.最后,利用該細(xì)胞系成功拯救出具有感染性的SVDV,并與親本毒的生物學(xué)特性作了比較.該策略使RNA拯救方法簡(jiǎn)化為一步快速的拯救方法.

6、利用該方法對(duì)CSFV C株進(jìn)行了拯救,進(jìn)行了拯救病毒的鑒定,并做了兔子致病性試驗(yàn). 三、以真核細(xì)胞RNA聚合酶Ⅰ系統(tǒng)為基礎(chǔ)的體內(nèi)拯救系統(tǒng)的建立和應(yīng)用為了克服那些難以適應(yīng)甚至沒有可適應(yīng)細(xì)胞系的病毒拯救難題,設(shè)計(jì)構(gòu)建了完全利用真核細(xì)胞聚合酶的RNA病毒體內(nèi)拯救系統(tǒng).先克隆出所需的真核RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子和終止子序列,建立RNA聚合酶I啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒.然后把SVDV全長(zhǎng)cDNA裝配進(jìn)該載體,在IBRS-2細(xì)胞內(nèi)和乳鼠體內(nèi)成功拯救出

7、了SVDV,第一次證明了聚合酶I系統(tǒng)能夠高效拯救細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的正鏈RNA病毒.并利用該拯救系統(tǒng)對(duì)FMDV進(jìn)行了拯救,首次證明該聚合酶I系統(tǒng)能夠轉(zhuǎn)錄出至少長(zhǎng)8.2 kb的轉(zhuǎn)錄本.在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建含有外源性生物標(biāo)記5819的SVDV HK/70全長(zhǎng)cDNA克隆,利用聚合酶I反向遺傳拯救系統(tǒng)拯救出含有該標(biāo)記的病毒.為制備含有基因標(biāo)記疫苗和建立鑒別診斷方法奠定一定的基礎(chǔ).該設(shè)計(jì)思路的實(shí)現(xiàn),拓寬了高效病毒拯救的途徑,為病毒反向遺傳學(xué)研究提供了更為高