Bmi-1誘導(dǎo)p16陽性的乳腺上皮細(xì)胞永生化及其機(jī)制.pdf

1、Bmi-1(B-cell-specific moloney leukemia virus insert site 1)基因?yàn)橐环N屬于PcG(Polycomb group)家族成員的致癌基因，1991年在鼠淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)，BMI-1蛋白也與果蠅PSC和SU(Z)2蛋白相似，其氨基端為指環(huán)結(jié)構(gòu)域，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用；中間部分為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角(helix turn helix turn，H-T-H-T)結(jié)構(gòu)，是DNA結(jié)合域，并與轉(zhuǎn)錄抑制

2、有關(guān)：羧基端為PEST序列，與BMI-1在細(xì)胞內(nèi)快速降解有關(guān)[1]。人Bmi-1基因定位于10號染色體短臂13區(qū)(該區(qū)域被認(rèn)為與各種白血病染色體易位有關(guān))，DNA大小為4.9 kb，mRNA為3199 bp，含10個(gè)外顯子，編碼含326個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為36.9KD。 Bmi-1參與干細(xì)胞的增殖、分化與衰老[2、3、4、5、6]，與腫瘤的發(fā)生[7、8、9、10、11]，腫瘤干細(xì)胞關(guān)系密切[4,12,13]，也可以引起細(xì)

3、胞永生化[14、15、16、17、18,19,20],Bmi-1的一個(gè)主要作用位點(diǎn)是INK4a，該位點(diǎn)可以編碼抑癌蛋白p16INK4a和p19ARF(人為p14ARF)，Bmi-1負(fù)性調(diào)控p16INK4A和P19ARF的表達(dá)，通過p16／細(xì)胞周期素(cyclin)D／Rb和p19／MDM2／p53通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和衰老[21,22]。Bmi-1能夠延長人成纖維細(xì)胞的生存期卻不能使其永生化[38]；而過表達(dá)Bmi-1可以使p16INK

4、4a正常表達(dá)的鼻咽上皮細(xì)胞繞過老化，發(fā)生永生化，在鼻咽上皮細(xì)胞中，Bmi-1使端粒酶的活性增強(qiáng)，p16INK4A的表達(dá)降低從而發(fā)生永生化[19]；亦有Bmi-1誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞永生化的報(bào)道，但是是建立在乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)過自我篩選后p16INK4A不表達(dá)的基礎(chǔ)上的，Bmi-1使這些p16INK4A表達(dá)缺失的乳腺上皮細(xì)胞端粒酶活性增強(qiáng)，發(fā)生永生化[20]。Bmi-1能否使p16INK4a正常表達(dá)的乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生永生化還未見有報(bào)道。Bmi-1

5、能激活包括乳腺上皮細(xì)胞在內(nèi)的正常上皮細(xì)胞端粒酶活性[18,19,20]，能夠使p16INK4A的表達(dá)降低[18,19]。在乳腺正常上皮細(xì)胞中，Bmi-1能否降低p16INK4A的表達(dá)?又是通過怎樣的機(jī)制來阻抑p16INK4A的表達(dá)呢? DNA甲基化是基岡沉默的一種方式，是較早發(fā)現(xiàn)的基岡表觀修飾方式之一，可能存在于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的所有高等牛物中。研究證明抑癌基因甲基化與腫瘤的發(fā)牛關(guān)系密切[23,24,25,26]。DNA甲基化是人類后成

6、論學(xué)說的豐要復(fù)制后修飾方式．它通常發(fā)生在胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基上。多種基岡的啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子富含CpG[29]，而CpG相對集中的區(qū)域稱為CpG島[27]。通常，CpG島大約含有500多個(gè)堿基。在哺乳動(dòng)物基因組中約有4萬個(gè)CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化[27]，在生理情況下，CpG島多為非甲基化的。DNA的甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’

7、甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調(diào)控了基因的表達(dá)[30]。DNA甲基化不僅在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，而且在癌變過程中扮演著重要角色。甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動(dòng)遺傳因子的激活、原癌基因的表達(dá))和抑癌基因的不表達(dá)[31]。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的

8、機(jī)率提高，例如：胰島素樣生長因子-2(IGF-2)基因印記丟失導(dǎo)致多種腫瘤，如Wilm's瘤[32]。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因失活有關(guān)[33]。由于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測[34]，而且全基因組的低甲基化也隨著腫瘤發(fā)生而出現(xiàn)，并且其隨著腫瘤惡性度的增加而顯著[35]。 研究內(nèi)容

9、和實(shí)驗(yàn)方法： 收集非癌乳腺活檢組織(女性)，進(jìn)行原代組織培養(yǎng)，建立正常乳腺上皮細(xì)胞，用Bmi-1誘導(dǎo)p16INK4a正常表達(dá)的乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生永生化。在永生化乳腺上皮細(xì)胞株建立的基礎(chǔ)上研究Bmi-1引起細(xì)胞永生化的可能機(jī)制。 細(xì)胞免疫組化：角蛋白染色證實(shí)所培養(yǎng)上皮細(xì)胞為上皮來源； 永生化細(xì)胞株的建立：乳腺上皮細(xì)胞感染pMSCV-Bmi-1以誘導(dǎo)其永生化，另外感染pMSCV作為對照；Western blot檢測Bm

10、i-1感染進(jìn)細(xì)胞后，持續(xù)培養(yǎng)觀察細(xì)胞的生存期。 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)：采用RT-PCR的方法檢測．Bmi-1通路中Gbx2，MKI67，CCNB1，BUB1，HEC，KIAA1063，HCFC1，RNF2，ANK3，F(xiàn)GFR2，CES在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。以明確Bmi-1感染進(jìn)細(xì)胞后是否會引起變化。 Western Blotting：在翻譯水平檢測p53，pRB通路各蛋白以及BMI-1，hTERT等蛋白的表達(dá)水平；

11、 端粒酶活性測定：判斷細(xì)胞永?；臉?biāo)志性實(shí)驗(yàn)之一，檢測Bmi-1感染進(jìn)細(xì)胞后引起端粒酶活性的變化。 倍增曲線分析：分析細(xì)胞倍增速率，倍增倍數(shù)； MSP法進(jìn)行甲基化檢測：提取細(xì)胞BN6-BMI-1及BN6-pMSCV的DNA，用亞硫酸氫鈉處理后，采用MSP法分析甲基化情況； 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.原代培養(yǎng)建立乳腺正常上皮細(xì)胞從手術(shù)室取非腫瘤病人乳腺組織，病理檢測結(jié)果為正常乳腺組織，將新鮮標(biāo)本經(jīng)無血清培養(yǎng)液

12、沖洗2次，剪成1mm3大小后種植于25cm培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，三天后可見到細(xì)胞從組織塊中長出，細(xì)胞小，活性好，呈梭形，貼壁生長，存在接觸抑制，未見重疊生長，命名為BN6。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后，胰酶消化傳代，4-6天傳代一次，細(xì)胞傳到第6代左右時(shí)(大約12個(gè)CPDs)，開始出現(xiàn)衰老死亡，細(xì)胞體積變大，活性降低，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)不再增加，逐漸死亡。細(xì)胞角蛋白染色顯示細(xì)胞BN6來自上皮細(xì)胞。Western blot分析CD-10，claudi

13、n-4及p16的表達(dá)情況證實(shí)細(xì)胞來自乳腺腺泡上皮細(xì)胞，其p161NK4a表達(dá)為陽性。 2.Bmi-1感染BN6建立永生化細(xì)胞株BN6-BMI-1. 制作逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCV-Bmi-1和pMSCV，用逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCV-Bmi-1和pMSCV感染細(xì)胞BN6，感染后的細(xì)胞用含有0.5ug／ml puromycin的培養(yǎng)基篩選3-5天。Western blot分析證明Bmi-1成功感染進(jìn)細(xì)胞。光鏡下細(xì)胞折光性增強(qiáng)，活性增強(qiáng)，形態(tài)未

14、發(fā)生明顯變化，細(xì)胞能越過危險(xiǎn)期持續(xù)生長超過100個(gè)倍增周期。 3.Bmi-1使細(xì)胞BN6永生化的機(jī)制Bmi-1能夠誘導(dǎo)篩選后的人乳腺上皮細(xì)胞端粒酶活性，也能夠誘導(dǎo)鼻咽上皮細(xì)胞端粒酶活性，我們想知道Bmi-1是否能夠激活未發(fā)生篩選p16陽性的乳腺上皮細(xì)胞的端粒酶活性，我們檢測了Bmi-1過表達(dá)細(xì)胞BN6-BMI-1和對照細(xì)胞BN6-pMSCV中端粒酶的表達(dá)水平和端粒酶活性，結(jié)果在BN6-BMI-l細(xì)胞中端粒酶的表達(dá)和活性明顯增高。

15、為了進(jìn)一步研究Bmi-1永生化乳腺上皮細(xì)胞BN6的可能機(jī)制，我們分析了Rb和p16信號通路，與對照細(xì)胞BN6-pMSCV相比，隨著傳代的增加，BN6-BMI-1細(xì)胞p16的表達(dá)逐漸降低，直至消失，Western blot檢測顯示BN6-BMI-1細(xì)胞中p16的表達(dá)在第10代之后消失，pRB的磷酸化水平有所增強(qiáng)，而P53等蛋白的表達(dá)未見明顯變化，提示p16／Rb信號通路的異?？赡茉贐mi-1誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞用升華的過程中起重要作用，所以B

16、mi-1使細(xì)胞BN6永生化的可能機(jī)制是：Bmi-1通過某種機(jī)制使細(xì)胞中p16的表達(dá)下調(diào)，從而使pRB的磷酸化水平增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞的生長和增殖，同時(shí)h-TERT在細(xì)胞BN6-BMI-1中的表達(dá)增強(qiáng)，端粒酶活性增強(qiáng)，細(xì)胞越過衰老凋亡，達(dá)到永生化。那么Bmi-1通過什么樣的機(jī)制引起p16表達(dá)下調(diào)的呢?已有研究證明多梳基因家族包括Bmi-1可能與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶機(jī)制相關(guān)聯(lián)，是否在乳腺細(xì)胞中Bmi-1可誘導(dǎo)p16啟動(dòng)區(qū)域的GpC島的甲基化從而使

17、p16的表達(dá)下調(diào)直至表達(dá)沉默?于是提取BN6-PMSCV及BN6-BMI-1細(xì)胞的基因組DNA，采用MSP法檢測p16的甲基化情況，結(jié)果顯示BN6-BMI-1中p16發(fā)生了甲基化，而對照細(xì)胞BN6-pMSCV未發(fā)生p16的甲基化。所以其可能機(jī)制為Bmi-1與甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用促使了p16的甲基化，使p16的表達(dá)沉默，磷酸化的Rb水平增高，p16／Rb信號通路發(fā)生異常導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生了早期轉(zhuǎn)化達(dá)到永?；?shí)驗(yàn)結(jié)論： 1.由單基因Bmi