蜈蚣提取液治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章蜈蚣提取液對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外抗癌作用及機(jī)制的研究
　　 目的:研究蜈蚣提取液對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的敏感性、作用的細(xì)胞周期時(shí)相及作用機(jī)制，為乳腺癌的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:體外培養(yǎng)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，采用不同濃度蜈蚣提取液（Extract of Centipede，ECP）予以干預(yù)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞的藥物濃度—時(shí)間生長(zhǎng)曲線研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的敏感性;利用倒置光學(xué)顯

2、微鏡和電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)的變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物治療組的細(xì)胞周期及其凋亡率;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Bax的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:①M(fèi)TT法揭示各濃度ECP對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)均有抑制作用。ECP在80mg/ml、40 mg/ml、20 mg/ml、10mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml及1.25 mg/ml下對(duì)MDA-MB-231的抑制率依次為(71.2

3、6±2.64)％、(62.48±6.67)％、(56.26±3.17)％、(48.63±4.48)％、(42.13±4.73)％、（34.5±2.98）％和(26.89±2.95)％，中效濃度為12.5mg/ml。②細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖顯示MDA-MB-231活細(xì)胞數(shù)目與ECP濃度及藥物作用時(shí)間相關(guān)。治療組濃度在12.5mg/ml與25mg/ml時(shí)，用藥后24小時(shí)活細(xì)胞數(shù)就顯著減少。各組間活細(xì)胞數(shù)比較差異明顯(P＜0.01)。③光鏡下見(jiàn)ECP

4、作用48小時(shí)后，濃度低于10mg/ml對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，濃度在10mg/ml以上時(shí)，MDA-MB-231活細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞形態(tài)變圓變小，80mg/ml時(shí)見(jiàn)細(xì)胞大片壞死，有較多的不規(guī)則細(xì)胞碎片，培養(yǎng)瓶中壞死脫落細(xì)胞增多。電鏡下見(jiàn)治療組細(xì)胞密度增高，染色質(zhì)凝集固縮，染色質(zhì)邊集，核固縮、核碎裂，及凋亡小體的形成。④流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn):(A) ECP在不同濃度下，G0/G1期所占的比例是不同的。對(duì)照組為（36.7±4.

5、2）％，濃度12.5mg/ml為（56.5±4.1）％，25mg/ml組最高，為（67.3±4.4）％。(B)細(xì)胞增殖指數(shù)(PI):在對(duì)照組為（63.3±3.2）％，濃度12.5mg/ml時(shí)為（43.5±3.5）％，25mg/ml時(shí)為（32.7±2.0）％，差異顯著(P＜0.05)。并且，隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞凋亡所出現(xiàn)的“亞G1峰”是逐步增高的。(C)細(xì)胞凋亡率:培養(yǎng)及作用48小時(shí)后對(duì)照組的自發(fā)凋亡率（2.15±0.13）％，濃度1

6、2.5mg/ml時(shí)為(13.01±1.51)％，25mg/ml時(shí)為(21.3±1.98)％，各濃度組間差異明顯(P＜0.05)。⑤免疫組化法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的Bcl-2和Bax表達(dá)，對(duì)照組中Bcl-2的OD值最大，染色最深、最多，隨ECP濃度加大，Bcl-2在MDA-MB-231細(xì)胞的OD值逐漸變小，染色逐步變少、變淺。在對(duì)照組中，Bax的OD值最小，染色淺而少，隨ECP濃度加大，表達(dá)Bax的細(xì)胞的OD值依次變大，染色逐步變

7、多，顏色加深。
　　 結(jié)論:①ECP能抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，且抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng);②ECP低濃度有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，中、高濃度有直接殺傷腫瘤細(xì)胞作用。③ECP作用MDA-MB-231細(xì)胞的G1/G0期，抑制其增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡，其作用呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng);④ECP治療三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后能促進(jìn)Bax基因的表達(dá)，抑制Bcl-2基因的表達(dá)。
　　 第二章蜈蚣提取液

8、體內(nèi)抑癌及作用機(jī)制的研究
　　 目的:研究蜈蚣提取液在體內(nèi)對(duì)乳腺癌是否有抑制作用，并探討蜈蚣提取液抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。
　　 方法:建立裸鼠MDA-MB-231人異位乳腺癌移植模型，以蜈蚣提取液予以灌服，觀察腫瘤生長(zhǎng)、乳腺癌轉(zhuǎn)移情況。②運(yùn)用免疫組化法對(duì)腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行Bcl-2、Bax、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF)和促血管生成素2(Angi

9、opoietin2，Ang-2)的檢測(cè)。
　　 結(jié)果:①裸鼠MDA-MB-231人異位乳腺癌移植模型成功率100％②蜈蚣提取液對(duì)裸鼠MDA-MB-231移植瘤有明顯抑制作用，在移植后第25天，對(duì)照組的腫瘤平均體積為(1011.52±212.68)mm3，治療組為(238.83±65.45) mm3;裸鼠處死后，對(duì)照組的腫瘤平均重量為（983±97.3）mg，治療組為(556±98.1)mg，抑制率達(dá)44.2％，兩組有顯著差異性。

10、③在對(duì)照組中，Bcl-2、VEGF與Ang-2的染色細(xì)胞數(shù)、染色強(qiáng)度及OD值均較治療組多而強(qiáng)，而Bax的染色強(qiáng)度、染色細(xì)胞數(shù)及OD值較治療組要少而弱，它們比較均有顯著性差異(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:蜈蚣提取液能抑制裸鼠MDA-MB-231移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)理與抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 第三章蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法分離治療組乳腺癌細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白
　　 目的:篩選蜈蚣提取液治療乳腺癌細(xì)胞

11、后的相關(guān)差異蛋白，探討藥物治療乳腺癌的機(jī)理。
　　 方法:運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法，采用一步抽提法制備乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株治療組和對(duì)照組的總蛋白質(zhì)，用雙向凝膠電泳技術(shù)建立了重復(fù)性和分辨率均較好的MDA-MB-231細(xì)胞株治療組和對(duì)照組總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜。PDQuest軟件對(duì)兩組細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行了比較，并采用MALDI-TOF-MS對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，獲取MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜

12、，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定主要差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果:①共發(fā)現(xiàn)76個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)(p＜0.05)。治療組中41個(gè)表達(dá)下調(diào)，35個(gè)表達(dá)上調(diào)。②選擇其中明顯的12個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)作為差異表達(dá)的質(zhì)譜分析，分析出11個(gè)差異蛋白。5個(gè)蛋白質(zhì)即:S100A9、CALML5、CK-19、Gal-7和α-烯醇化酶在MDA-MB-231治療組中表達(dá)上調(diào);而6個(gè)蛋白質(zhì)即GSTO1-1、PGAMA、HSP90-β、AKP-P、IMPDH和GAPDH在MD

13、A-MB-231治療組中表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:①對(duì)雙向凝膠電泳圖譜分析共發(fā)現(xiàn)76個(gè)差異表達(dá)蛋白，41個(gè)表達(dá)下調(diào)，35個(gè)表達(dá)上調(diào)。②質(zhì)譜分析11個(gè)差異蛋白，S100A9、CALML5、CK-19、Gal-7和α-烯醇化酶在MDA-MB-231治療組中表達(dá)上調(diào);而6個(gè)蛋白質(zhì)即GSTO1-1、PGAMA、HSP90-β、AKP-P、IMPDH和GAPDH在MDA-MB-231治療組中表達(dá)下調(diào)。提示蜈蚣提取液能多途徑抑制乳腺癌細(xì)胞的生

14、長(zhǎng)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡或直接死亡。
　　 第四章部分蛋白質(zhì)分子差異表達(dá)水平驗(yàn)證研究
　　 目的:驗(yàn)證比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果。
　　 方法:采用Western-blot技術(shù)對(duì)S100A9蛋白、細(xì)胞角蛋白19、半乳凝素-7在MDA-MB-231細(xì)胞株治療組與對(duì)照組中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:S100A9蛋白、細(xì)胞角蛋白19、半乳凝素-7在MDA-MB-231治療組中表達(dá)上調(diào)，與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果