大鼠肝干細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞間生物學(xué)特性差異分析及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　干細(xì)胞研究是近些年來的研究熱點(diǎn)，其中包括正常干細(xì)胞（normalstemcells,NSCs）和腫瘤干細(xì)胞（cancerstemcells,CSCs），針對(duì)這些干細(xì)胞的深入研究對(duì)于許多疾病的診治具有十分重要的意義。NSCs無論對(duì)于機(jī)體的正常功能維持，還是對(duì)于疾病的異常功能修復(fù)，都占據(jù)著至關(guān)重要的地位。干細(xì)胞治療是急、慢性終末期肝病最有前景的療法，可用于肝病治療的干細(xì)胞類型眾多，主要分為肝內(nèi)干細(xì)胞和肝外干細(xì)胞兩類。胎肝

2、干/祖細(xì)胞（fetalliverstem/progenitorcells,FLSPCs）屬于肝內(nèi)干細(xì)胞的典型代表，因其高存活、高增殖、小體積和高安全優(yōu)勢(shì)，成為干細(xì)胞治療肝病的理想細(xì)胞之一。本課題應(yīng)用三步分離法富集了FLSPCs，獲得了與流式分選近似的分離效率。然而，要探索FLSPCs治療潛能，以下兩個(gè)問題急待解決：首先，如何保持FLSPCs自我更新；其次，如何促進(jìn)FLSPCs準(zhǔn)確分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。
　　肝細(xì)胞癌(hepato

3、cellularcarcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是最易致死的癌癥類型，全世界每年新發(fā)HCC中的40％～50％在我國大陸。雖然近幾年HCC的診斷和治療得到了一些發(fā)展，但是闡明HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)理仍是解決HCC診治的根本途徑。HCC被推測(cè)起源于一小群細(xì)胞，這些細(xì)胞具有諸多類似干細(xì)胞的特征，因此被稱為肝癌干細(xì)胞（hepaticcancerstemcells,HCSCs）。HCSCs起源起源被認(rèn)為是HCC的重要發(fā)生

4、機(jī)制之一，而HCC干細(xì)胞的來源之一被推測(cè)是正常肝干細(xì)胞（hepatcinormalstemcells,HNSCs）在誘癌因素刺激下發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化所致。因此，對(duì)比HNSCs和HCSCs之間的生物學(xué)特性差異，對(duì)于理解兩者之間的相互關(guān)系具有重要意義。利用建立的干細(xì)胞分離法，本課題富集了HNSCs和HCSCs，對(duì)比了兩種干細(xì)胞之間的生物學(xué)特性差異，并建立了兩種干細(xì)胞間小RNA（microRNA,miRNA）和基因差異表達(dá)譜。
　　雖然HCS

5、Cs被推測(cè)來自于HNSCs的惡性轉(zhuǎn)化，但是尚缺乏實(shí)際性的生物轉(zhuǎn)化模型，同時(shí)參與該過程的具體分子機(jī)制尚不清楚。從獲得的miRNA差異表達(dá)譜中，本課題挑選了在HCSCs極度下調(diào)的miRNA，miR-200a進(jìn)行了深入研究。我們發(fā)現(xiàn)HNSCs中抑制miR-200a的表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖明顯加快，并具有一定的侵襲和遷移能力，最終導(dǎo)致HNSCs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化成為類似HCSCs的細(xì)胞。雖然上述研究結(jié)果已在“StemCellRev”等多篇高水平國際雜志發(fā)

6、表，但是miR-200a缺失介導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制尚不清楚。通過鑒定miR-200a缺失后影響的下游靶基因，我們發(fā)現(xiàn)ZEB作為miR-200a的靶基因參與了HNSCs向HCSCs惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用。為了分析失調(diào)性miRNAs作為診斷HCC的分子標(biāo)志物的可能性，我們對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠HCC發(fā)生的各個(gè)階段進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-200a的失調(diào)早于AFP的變化，有望是一個(gè)潛在的標(biāo)志物。
　　【目的】
　　總體目標(biāo)是對(duì)比HN

7、SCs和HCSCs間的生物學(xué)特性，探索從HNSCs向HCSCs惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。主要包括三個(gè)具體目標(biāo)：（1）大規(guī)模培養(yǎng)FLSPCs并保持其未分化狀態(tài)，確定促進(jìn)FLSPCs定向分化的優(yōu)化條件。（2）系統(tǒng)對(duì)比HNSCs和HCSCs間的生物學(xué)特性，建立HNSCs和HCSCs間差異基因和miRNA表達(dá)譜。（3）選取代表性的miRNA或者基因，探索其介導(dǎo)HNSCs向HCSCs惡性轉(zhuǎn)化過程中的部分關(guān)鍵分子機(jī)制。
　　【方法】
　　第一

8、部分：HNSCs和HCSCs的分離鑒定
　　1、FLSPCs的三步分離法富集（此部分已入碩士論文）
　　利用Percoll非連續(xù)密度梯度離心（percolldiscontinuousgradientcentrifugation,PDGC）、差異消化和差異貼壁（differentialtrypsinizationanddifferntialadherence,DTDA）、Percoll連續(xù)密度梯度離心（percollconti

9、nuousgradientcentrifugation,PCGC）三個(gè)系列步驟成功分離了FLSPCs。
　　2、HCSCs的三步分離法富集（此部分與王興碩士合作完成，詳見其論文）
　　利用二乙基亞硝胺造就Fisher344大鼠HCC模型，利用PDGC富集肝癌細(xì)胞（heptatictumorcells,HTCs），通過DTDA對(duì)分離的HTCs進(jìn)行純化，采取PCGC從純化的HTCs根據(jù)密度大小不同富集HCSCs。
　　3、

10、正常肝邊緣（sidepopulationfromhepaticnormalcells,SP-HNCs）分離
　　四氯化碳造就Fisher344大鼠的肝損傷模型，刺激肝內(nèi)干細(xì)胞動(dòng)員，制備正常肝細(xì)胞（hepaticnormalcells,HNCs）的單細(xì)胞懸液。根據(jù)干細(xì)胞亞群具有主動(dòng)外排染料特性，利用熒光激活的細(xì)胞分選術(shù)（fluorescenceactivatedcellsorting,FACS）富集邊緣群（sidepopulatio

11、n,SP）的方法分離SP-HNCs。
　　4、肝癌邊緣細(xì)胞（sidepopulationfromhepatictumorcells,SP-HTCs）分離
　　根據(jù)CSCs亞群具有主動(dòng)外排染料的特性，將HTCs和Hoechst33342染料共孵育，設(shè)定SP的范圍所在，分離出SP-HTCs。
　　第二部分：HNSCs的擴(kuò)增培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
　　1、建立FLSPCs的體外擴(kuò)增體系
　　進(jìn)行FLSPCs的有效擴(kuò)增，并

12、保持其處于未分化狀態(tài)，我們將FLSPCs利用夾心法培養(yǎng)于上稀下密的雙層軟瓊脂之間，同時(shí)添加白血病分化抑制因子（leukaemiainhibitoryfactor,LIF）。培養(yǎng)一段時(shí)間，以貼壁培養(yǎng)的FLSPCs作為參照，分析FLSPCs經(jīng)過軟瓊脂擴(kuò)增后，其干細(xì)胞特性是否發(fā)生變化。
　　2、建立FLSPCs的定向分化體系
　　單獨(dú)添加不同濃度的二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO），找到促進(jìn)FLSPCs分化

13、為HNCs的最適宜DMSO濃度；單獨(dú)添加不同濃度的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocellulargrowthfactor,HGF），明確誘導(dǎo)FLSPCs分化為HNCs的最適宜HGF濃度；聯(lián)合添加HGF和DMSO誘導(dǎo)FLSPCs分化，與單獨(dú)誘導(dǎo)的效果對(duì)比，確定誘導(dǎo)FLSPCs分化的適合方案。
　　第三部分：HNSCs和HCSCs間的核酸差異譜
　　1、HNSCs和HCSCs間的miRNA差異譜
　　從SP-HNCs和SP-

14、HTCs中分別分離總RNA。通過miRNA微陣列技術(shù)對(duì)比兩種干細(xì)胞的miRNA表達(dá)差異，同時(shí)選取失調(diào)的代表性miRNAs，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證失調(diào)表達(dá)的可靠性。以上調(diào)兩倍、下調(diào)1/2作為失調(diào)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、HNSCs和HCSCs間的基因差異譜
　　通過抑制性削減雜交技術(shù)對(duì)比SP-HNCs和SP-HTCs的基因表達(dá)差異，選取失調(diào)的代表性基因，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證失調(diào)表達(dá)的可靠性。以上調(diào)兩倍、下調(diào)1/2作為失調(diào)

15、的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。
　　第四部分：HNSCs向HCSCs的惡性轉(zhuǎn)化
　　1、惡性轉(zhuǎn)化模型的建立
　　從SP-HNCs和SP-HTCs間miRNA差異表達(dá)譜中挑選出在SP-HTCs下調(diào)幅度最大的miR-200a。利用RNAi技術(shù)干涉FLSPCs中miR-200a的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)定量和原位雜交技術(shù)驗(yàn)證miR-200a的抑制效果。
　　2、惡性轉(zhuǎn)化效果的驗(yàn)證
　　光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察miR-200a抑制前后細(xì)胞的形

16、態(tài)變化；流式細(xì)胞技術(shù)等檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化（包括細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡）；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲、遷移能力變化；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察miR-200a抑制前后細(xì)胞成瘤能力變化，以及細(xì)胞對(duì)受體肝臟的損害情況。
　　3、惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制
　　利用常用miRNA-靶基因預(yù)測(cè)系統(tǒng)預(yù)測(cè)miR-200a參與調(diào)控的基因；與建立的HNSCs和HCSCs間基因差異譜對(duì)比，挑選出可能的靶基因；通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和west

17、ernblotting等技術(shù)，驗(yàn)證miR-200a調(diào)控的靶基因。
　　第五部分：MiR-200a與HCC發(fā)生的相關(guān)性分析
　　1、大鼠HCC模型的建立及階段的劃分
　　利用二乙基亞硝胺造就Fisher344大鼠HCC模型，根據(jù)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果，將整個(gè)HCC發(fā)生過程分為六個(gè)階段，依次為：正常肝階段、變性肝階段、纖維化階段、肝硬化階段、早期癌階段、晚期癌階段。
　　2、MiR-200a表達(dá)水平的檢測(cè)
　　分別收集

18、六個(gè)階段的組織和血清標(biāo)本，組織標(biāo)本利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR-200a的表達(dá)，血清利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-200a的表達(dá)水。
　　3、MiR-200a與病理資料的相關(guān)性分析
　　分析各階段組織miR-200a表達(dá)水平與血清miR-200a表達(dá)水平之間的相關(guān)性；分析各階段中miR-200a表達(dá)水平與病理評(píng)分之間的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】
　　第一部分：HNSCs和HCSCs的分離鑒定
　　1、FLSP

19、Cs的三步分離法富集（此部分已入碩士論文）
　　三步分離法富集的FLSPCs是位于PCGC分離后第一、二層的細(xì)胞。這些細(xì)胞個(gè)頭較小，具有較大的核/漿比，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD133和CD49f，低表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)志，同時(shí)能夠自行分化為表達(dá)ALB的類成熟肝細(xì)胞。
　　2、HCSCs的三步分離法富集（此部分與王興碩士合作完成，詳見其論文）
　　三步分離法富集的HCSCs是位于PCGC分離后第三層的細(xì)胞。這些細(xì)胞具有較大的核/

20、漿比，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD133和EpCAM，具有較強(qiáng)的體外增殖、侵襲、遷移、化療耐藥能力，體內(nèi)移植該類細(xì)胞后其能快速在裸鼠皮下成瘤，同時(shí)遷移到肝臟形成腫瘤。
　　3、SP-HNCs的分離
　　SP-HNCs的比例約占HNCs的4％，這些細(xì)胞直徑約為7-15μm，具有較大的核/漿比，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志，低表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)志，能夠被HGF誘導(dǎo)為表達(dá)ALB的類成熟肝細(xì)胞，體內(nèi)移植SP-HNCs能修復(fù)鼠急性肝損傷。
　　4、S

21、P-HTCs的分離
　　SP-HTCs具有較大的核/漿比，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志，具有較強(qiáng)的體外增殖、遷移能力，HGF誘導(dǎo)能促使該類細(xì)胞分化為低表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志的HTCs，體內(nèi)移植該類細(xì)胞后其能快速在裸鼠皮下成瘤，同時(shí)遷移到肝臟形成腫瘤。
　　第二部分：HNSCs的擴(kuò)增培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
　　1、建立FLSPCs的體外擴(kuò)增體系
　　與貼壁培養(yǎng)的FLSPCs相比，雙層軟瓊脂半懸浮培養(yǎng)的FLSPCs個(gè)頭更小、具有更大核漿比、形成

22、明顯的堿磷的強(qiáng)陽性克?。还δ軐W(xué)方面：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD49f和CD90、高表達(dá)未成熟肝細(xì)胞標(biāo)志AFP、低表達(dá)率成熟肝細(xì)胞標(biāo)志ALB。
　　2、建立FLSPCs的定向分化體系
　　促進(jìn)FLSPCs分化為HNCs的最適宜DMSO濃度為1％；HGF的最適宜誘導(dǎo)濃度為20ng/ml；與單獨(dú)誘導(dǎo)對(duì)比，聯(lián)合HGF和DMSO能更好地誘導(dǎo)FLSPCs分化。
　　第三部分：HNSCs和HCSCs間的差異譜