內(nèi)毒素耐受CD11C1ow CD45RBhigh DC對(duì)肝衰竭小鼠A20表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的:急性肝衰竭(ALF)是由各種原因?qū)е麓罅扛渭?xì)胞壞死及凋亡，使肝臟生理功能遭到嚴(yán)重?fù)p害。在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，肝細(xì)胞的大量壞死和凋亡可導(dǎo)致全身炎癥綜合征，最終誘導(dǎo)急性肝衰竭。臨床上，約60％的ALF患者存在全身性炎癥綜合征，進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)。急性肝衰竭的患者預(yù)后極差，死亡率高，且目前缺乏有效的治療方法[5,6]。預(yù)先給予小劑量LPS或類似物質(zhì)刺激機(jī)體或單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)后，機(jī)體或細(xì)胞對(duì)致死劑量的LPS表現(xiàn)為低反

2、應(yīng)性或無反應(yīng)性的現(xiàn)象，稱為內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance，ETT)。研究顯示內(nèi)毒素耐受狀態(tài)可以明顯減輕肝組織炎性壞死及肝功能損害的嚴(yán)重程度，體內(nèi)內(nèi)毒素及炎性介質(zhì)水平下降，抗內(nèi)毒素能力增強(qiáng)，推測(cè)可能與天然免疫調(diào)控有關(guān)。
　　樹突狀細(xì)胞(DC)是天然免疫和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞，是目前功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(ant igen present ing cell，APC)，DC不僅能激活未致敏T細(xì)胞，還可分泌細(xì)胞因子

3、調(diào)節(jié)獲得性免疫。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠脾臟可分離出一類新的樹突細(xì)胞(DC)亞群CD11clowCD45RBhigh DCs，具有低表達(dá)CD11c、高表達(dá)CD45RB，并且可以使IL-6和TNF-α等炎癥因子的釋放延后，在調(diào)控小鼠燙傷及嚴(yán)重感染模型的炎癥反應(yīng)中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[7，8]。A20蛋白，又稱腫瘤壞死因子a誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)，可抑制炎癥反應(yīng)、阻止細(xì)胞凋亡、保護(hù)組織細(xì)胞，在細(xì)胞損傷和炎癥中起著重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)通

4、過觀察急性肝衰竭小鼠模型中A20的動(dòng)態(tài)表達(dá)，以及內(nèi)毒素耐受小鼠脾臟分離出的樹突細(xì)胞(DC)亞群CD11clowCD45RBhigh DCs干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響，探討內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs在急性肝衰竭治療中可能作用機(jī)制。
　　方法:取健康雄性Balb/c小鼠120只，隨機(jī)分為正常組(80只)和內(nèi)毒素耐受組（40只）。腹腔注射0.2ml LPS（0.5ug/ml，溶于生理鹽水中），每日1次，連續(xù)5天，建立

5、內(nèi)毒素耐受小鼠模型，正常組則腹腔注射等體積的生理鹽水。采用10％水合氯醛麻醉，打開腹腔，無菌取脾后，經(jīng)免疫磁珠分選(magnetic cellsorting，MACS)技術(shù)分選正常組CD11clowCD45RBhigh DCs以及內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs。
　　另取健康雄性Balb/c小鼠126只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（6只）、急性肝功能衰竭(ALF)組（40只）和正常CD11clowCD45RBhig

6、DCs治療組（40只），內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBgigh DCs治療組（40只）。造模前小鼠禁食24小時(shí)，期間觀察大鼠的精神狀態(tài)、活躍度等情況，24小時(shí)后，ALF組與正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組及內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs治療組同時(shí)腹腔注射D-GalN600mg/kg和LPS10μg/只，半小時(shí)后兩治療組分別腹腔注射正常CD11clowCD45RBhighDCs（1×1

7、06/只，0.2ml/只）及內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs（1×106/只，0.2ml/只）進(jìn)行干預(yù)，正常對(duì)照組及急性肝功能衰竭(ALF)組則給予相同劑量的生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。各模型組（正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組，內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs治療組及ALF組）分別隨機(jī)留取10只小鼠（共30只），觀察7d內(nèi)死亡率。其余小鼠在注射后2h、6h、12h、24h和48h

8、等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組分別隨機(jī)取6只小鼠留取血及肝臟標(biāo)本。10％水合氯醛按0.5mL/kg體重腹腔注射麻醉小鼠，摘除眼球法采血離心取上清，打開腹腔，留取小鼠肝臟組織，其中大部分肝組織放于-80℃冰箱凍存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);其余置于1％中性甲醛溶液中固定后石蠟包埋，用于制備組織切片HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理變化;全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組小鼠生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的變化;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PC

9、R)檢測(cè)A20、TNF-α、核因子κB(NF-κB)(p65)mRNA表達(dá)情況;Western-Blot檢測(cè)各組小鼠肝組織A20、TNF-α和核因子κB(NF-κB)(p65)蛋白的表達(dá)情況。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)和Dunnet's T檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組與內(nèi)毒素耐

10、受CD11clowCD45RBhigh DCs治療組及ALF組小鼠腹腔注射D-GalN600 mg/kg和LPS10μ g/只后，7d內(nèi)死亡率分別為50％(5/10)、30％(3/10)和70％(7/10)。
　　HE染色顯示正常對(duì)照組肝小葉結(jié)完整，肝細(xì)胞形態(tài)飽滿，肝索排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤。ALF組小鼠肝細(xì)胞破壞嚴(yán)重，小葉結(jié)構(gòu)破碎，肝細(xì)胞條索紊亂，肝細(xì)胞水腫、變性，部分細(xì)胞溶解碎裂，同時(shí)匯管區(qū)可見大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。

11、正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組小鼠肝細(xì)胞破壞，小葉結(jié)構(gòu)破碎，肝細(xì)胞條索紊亂，肝細(xì)胞水腫、變性，部分細(xì)胞溶解碎裂，同時(shí)匯管區(qū)可見大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤較ALF改善。內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs治療組HE染色顯示肝細(xì)胞破壞程度較輕，部分細(xì)胞溶解碎裂，肝組織壞死灶及匯管區(qū)可見少量炎性細(xì)胞浸潤，程度明顯輕于正常CD11clowCD45RBhigh DCs及ALF組。
　　血清生化檢測(cè)

12、顯示，肝衰竭組(ALF)在造模2h后ALT、AST開始逐漸升高，于24h達(dá)高峰（分別為7856.00±618.054U/L和11248.67±2383.237U/L），明顯高于正常對(duì)照組(ALT和AST分別為34.00±2.000U/L和42.33±2.082U/L)(P＜0.05);正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組于造模2h后ALT、AST也逐漸升高，于24h達(dá)高峰（分別為3614.33±352.781U/L和4

13、067.33±226.630U/L），與肝衰竭組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs治療組于造模2h后ALT、AST逐漸增加，于24h達(dá)高峰(分別為1062.67±119.755U/L和1296.33±178.691U/L)，但與正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組及肝衰竭組24h比較明顯緩解(P＜0.05)。
　　RT-PCR結(jié)果顯示，肝衰竭組中，TNF

14、-αmRNA，NF-κB(p65) mRNA表達(dá)量隨著時(shí)間的推移逐漸增高，至12h達(dá)高峰(分別是1.382988±0.0046303和1.467528±0.0042249)，與正常對(duì)照組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);A20 mRNA則隨著時(shí)間的延長逐漸降低，在12h達(dá)到最低(0.369496±0.0137469)，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組中，TNF-

15、αmRNA，NF-κB(p65) mRNA表達(dá)量隨著時(shí)間的推移逐漸增高，至12h達(dá)高峰（分別是1.137201±0.0211250和1.035616±0.0253791），與肝衰竭組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); A20mRNA則隨著時(shí)間的延長逐漸增加，在12h達(dá)到最高(0.942636±0.0213513)，與肝衰竭組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs治療組TNF-αm

16、RNA，NF-κB(p65) mRNA表達(dá)量也隨著時(shí)間的推移逐漸增高，至12h達(dá)高峰(分別是0.948602±0.0177352和0.883716±0.0024897)，但明顯低于同時(shí)間點(diǎn)肝衰組及正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組;A20 mRNA則隨著時(shí)間的延長逐漸增高，于12h點(diǎn)達(dá)到最高(1.062646±0.0152213)，與肝衰竭組及正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義(P＜0.05)。
　　Western Blotting結(jié)果顯示，肝衰竭組中，TNF-α與NF-κB(p65)蛋白表達(dá)量均隨著時(shí)間的推移逐漸增高，至12h達(dá)高峰（分別是1.969786±0.0101808和1.679723±0.0089470），與正常對(duì)照組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);A20蛋白量則隨著時(shí)間的延長逐漸降低，在12h達(dá)到最低(0.816014±0.0090581)，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

18、.05)。正常CD11clowCD45RBhigh DCs治療組中，TNF-α與NF-κB(p65)蛋白表達(dá)量均隨著時(shí)間的推移逐漸增高，至12h達(dá)高峰（分別是1.507524±0.0321781和1.426531±0.0067164），與正常對(duì)照組及肝衰竭組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); A20蛋白量的表達(dá)水平則隨著時(shí)間的延長逐漸降高，在12h達(dá)到最高(1.663070±0.0252433)，與正常對(duì)照組及肝衰竭組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

19、異(P＜0.05)。內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs治療組TNF-α與NF-κB(p65)蛋白表達(dá)量也隨著時(shí)間的推移逐漸增高，至12h達(dá)高峰（分別是1.230424±0.0079228和1.227879±0.0048040），但明顯低于同時(shí)間點(diǎn)肝衰組及正常CD11clowCD45RBhigh DCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);A20蛋白表達(dá)量則隨著時(shí)間的延長逐漸增高，在12h達(dá)到最高(1.920760±0.

20、0032334)，與肝衰竭組及正常CD11clowCD45RBhigh DCs相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs干預(yù)后，可以明顯提高急性肝衰竭小鼠的存活率，減輕炎癥水平;小鼠肝臟中TNF-αmRNA、NF-κB(P65)表達(dá)水平下調(diào)，可能與A20高表達(dá)導(dǎo)致下游NF-κB表達(dá)減少有關(guān)。提示內(nèi)毒素耐受CD11clowCD45RBhigh DCs可能通過調(diào)節(jié)A20活性