高復(fù)制性阿德福韋酯耐藥-缺失變異HBV株的克隆及部分生物學(xué)特性分析.pdf

1、世界上超過3.5億的人口感染乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)，HBV感染仍然是全球的健康問題。慢性乙型肝炎病毒持續(xù)感染可能會(huì)演變?yōu)楦斡不透伟?，每年死于HBV感染相關(guān)的肝衰竭、肝細(xì)胞癌達(dá)百萬。故臨床治療仍然是很大的挑戰(zhàn)。核苷（酸）類似物類抗病毒藥物的出現(xiàn)及廣泛應(yīng)用，對長期抑制病毒、延緩疾病進(jìn)展、減少并發(fā)癥的發(fā)生起到了關(guān)鍵性的作用。該類藥物主要作用于HBV的聚合酶RT區(qū)而發(fā)揮抗病毒作用，顯著抑制HBV的復(fù)制、改善肝功

2、能和組織學(xué)損傷。但要鞏固療效需長期維持治療。長期治療勢必誘導(dǎo)乙肝病毒耐藥株的產(chǎn)生，引起臨床治療失敗。乙型肝炎病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒，逆轉(zhuǎn)錄過程中因逆轉(zhuǎn)酶無校對功能，造成基因突變高發(fā)。在藥物選擇壓力下，HBV耐藥株更易成為優(yōu)勢株。因此，一旦臨床治療過程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破等治療失敗的情況，均應(yīng)進(jìn)一步分析其耐藥情況。體外表達(dá)質(zhì)粒研究HBV復(fù)制特性及藥物敏感性，對特殊耐藥株的深入研究尤為重要，可將臨床分離株的在體外得以真實(shí)表達(dá)，指導(dǎo)臨床合理治療、評價(jià)藥

3、物療效。對臨床耐藥HBV毒株的研究需構(gòu)建能反映感染者體內(nèi)HBV株生物學(xué)功能的體外表達(dá)克隆。為此，我們開展了以下工作:
　　第一部分構(gòu)建含臨床分離株HBV基因的體外表達(dá)質(zhì)粒及基因序列分析
　　目的:由臨床發(fā)現(xiàn)的耐藥患者血清構(gòu)建含其HBV基因的體外復(fù)制質(zhì)粒，進(jìn)行序列分析。方法:將臨床上一名接受拉米夫定、阿德福韋序貫治療產(chǎn)生病毒學(xué)突破且HBV高載量的患者血清，抽提HBVDNA、RT區(qū)擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)其具有阿德福韋酯相關(guān)耐藥位點(diǎn)變異及S區(qū)

4、缺失，進(jìn)一步行HBV全基因擴(kuò)增、HBV全長測序、序列分析及全基因克隆。以臨床株HBV全基因克隆為基礎(chǔ)將HBV全長連接至PHY106載體，構(gòu)建含1.1倍HBV基因信息的體外復(fù)制質(zhì)粒。同時(shí)應(yīng)用相同載體(PHY106)構(gòu)建含1.1倍野生型HBV的體外復(fù)制質(zhì)粒作為參照，為隨后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)做基礎(chǔ)。結(jié)果:由患者血清抽提HBVDNA，行PCR全基因擴(kuò)增，成功將該病毒株的HBV連至PUC19載體構(gòu)建全基因克隆共6個(gè)。發(fā)現(xiàn)該例特殊變異株的6個(gè)克隆全部存在阿

5、德福韋酯相關(guān)耐藥位點(diǎn)rtA181T變異，4株聯(lián)合rtN236T變異，且6克隆均在其PreS1區(qū)發(fā)現(xiàn)長達(dá)207bp的缺失，并且在S區(qū)均意外出現(xiàn)兩個(gè)終止變異。將此6個(gè)HBV全基因克隆全部成功構(gòu)建為含1.1拷貝HBV基因組的體外復(fù)制質(zhì)粒以進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性。結(jié)論:由臨床血清分離的HBV特殊變異株可成功構(gòu)建用于體外研究的可復(fù)制質(zhì)粒。
　　第二部分高復(fù)制性乙肝病毒臨床分離株的體外復(fù)制及表型耐藥研究
　　目的:研究臨床特殊變異株的部

6、分生物學(xué)特性。方法:將第一部分構(gòu)建的HBV1.1倍體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系(Huh7)，細(xì)胞上清液中HBsAg及HBeAg的水平用ELISA法檢測，了解其對HBsAg分泌的影響。采用Southernblot技術(shù)研究該特殊變異株較野生株的HBV復(fù)制水平，并應(yīng)用臨床常用核苷類抗病毒拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替諾福韋進(jìn)行表型耐藥試驗(yàn)，對該特株變異株部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果:Southernblot結(jié)果提示該特殊變異株復(fù)制能力較野生株明顯