沉默TRPV1基因對利多卡因所致細胞凋亡的影響及其機制.pdf

1、目的：
　　構建針對人TRPV1基因的pSUPERretro-puroTRPV1逆轉錄病毒表達載體，感染U87-MG細胞，觀測其沉默TRPV1基因的效果。通過沉默TRPV1基因觀測利多卡因處理后對U87-MG的細胞狀態(tài)和凋亡情況的影響，以探討利多卡因是否通過TRPV1產生神經毒性損傷。
　　方法：
　　利用Ambion在線設計軟件設計針對人TRPV1基因的shRNA干擾序列，克隆到pSUPERretro-puro載體上

2、。對重組質粒進行DNA序列測定和酶切分析。用磷酸鈣法制備pSUPERretro-puroTRPV1逆轉錄病毒，將其感染到U87-MG細胞，經嘌呤酶素篩選陽性克隆后采用熒光定量PCR及Westernblotting法檢測TRPV1表達。U87-MG的細胞分為空白對照組、基因沉默組以及空載體組。對于每個組的細胞，我們利用流式細胞技術，研究利多卡因處理后不同時間點的細胞內鈣離子濃度及線粒體膜電位情況。并通過MTT方法和流式細胞術，檢測U87-

3、MG細胞的活力和凋亡情況。
　　結果：
　　經DNA測序和酶切鑒定表明，pSUPERretro-puroTRPV1表達載體構建成功。pSUPERretro-puroTRPV1逆轉錄病毒感染U87-MG細胞后，細胞中TRPV1表達量明顯降低。U87-MG細胞活力隨著利多卡因處理濃度增高而降低。利多卡因處理各組細胞后隨著時間增加，細胞內鈣離子濃度逐漸上升。TRVP1基因沉默組的各時點鈣離子濃度顯著比其他各組低（P<0.05）。利

4、多卡因處理后，對照組U87-MG細胞的線粒體膜電位明顯下降，而在TRVP1基因沉默組線粒體膜電位較高（P<0.05）。同時，流式細胞結果顯示，利多卡因處理后，各組的細胞凋亡增高，而在TRVP1基因沉默組則明顯低于對照組（P<0.05）。
　　結論：
　　成功構建了針對人TRPV1基因的pSUPERretro-puroTRPV1表達載體。pSUPERretro-puroTRPV1能有效下調TRPV1基因在U87-MG細胞中的表