MK-801對(duì)利多卡因致大鼠中毒驚厥效應(yīng)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用鹽酸利多卡因致大鼠中毒驚厥模型，測定中毒驚厥過程中海馬CA1區(qū)細(xì)胞外液谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)含量，并應(yīng)用N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)拮抗劑MK-801，觀察的NMDAR1活性以及Glu和GABA含量的變化，探討MK-801在利多卡因致大鼠中毒驚厥過程中的作用機(jī)制。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的制備 22只Wistar雄性大鼠，體重250±20 g(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)

2、物中心提供)。隨機(jī)分為3組，對(duì)照組(C組，6只)、利多卡因組(L組，8只)、MK-801+利多卡因組(MK-801+L組，8只)。大鼠異氟烷(isoflurane)麻醉后氣管插管，手術(shù)過程中持續(xù)吸入3％異氟烷維持麻醉，右股靜脈切開置管以1ml/h的速度輸入乳酸鈉林格氏液。刺入電極持續(xù)監(jiān)測心電圖(ECG)和腦電圖(EEG)。用微型顱鉆在左側(cè)海馬CA1區(qū)(前囟[bregma]后方3.6mm和中線左旁開2mm處)打開一直徑約2mm的圓孔，小心

3、挑開硬腦膜，將微透析針垂直刺入大腦皮層2mm，以2μl/min的速度持續(xù)輸注乳酸鈉林格氏液。手術(shù)操作完成后，持續(xù)吸入1.5％異氟烷維持麻醉。微透析針置入60 min后開始收集腦組織微透析液，每隔10min收集一次，首先收集20 min，之后按照實(shí)驗(yàn)分組給與不同的處理。 (1)C組：腹腔注射生理鹽水0.5 mg/kg，30 min后繼續(xù)收集透析液40 min，于-20℃冰箱內(nèi)保存待測。 (2)L組：腹腔注射生理鹽水0.5

4、mg/kg，30 min后2％利多卡因2mg靜注，然后以4 mg·kg-1·min-1的速度經(jīng)股靜脈持續(xù)泵入，C組以相同速度靜注或泵入乳酸鈉林格氏液。觀察驚厥波(EEG上出現(xiàn)振幅超過100 μV寬大快速的棘波并持續(xù)10 s以上)出現(xiàn)后，停止泵入利多卡因，其他兩組泵入利多卡因或乳酸鈉林格氏液時(shí)間與所求得的預(yù)試驗(yàn)中L組輸入利多卡因時(shí)間的95％可信區(qū)間相當(dāng)，記錄驚厥波發(fā)生及持續(xù)時(shí)間，呼吸抑制及持續(xù)時(shí)間，余操作與C組相同。 (3)MK-

5、801+L組：靜脈泵入利多卡因前30 min腹腔注射MK-801 0.5 mg/kg，余操作與L組相同。各組分別在微透析針置入60分鐘及L組開始出現(xiàn)驚厥波時(shí)(其他兩組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn))兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集股動(dòng)脈血測動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)，呼吸抑制期間給與輔助呼吸，以維持PaO2和PaCO2在正常范圍。 2.標(biāo)本的采集及檢測方法 2.1 NMDAR1表達(dá)的檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2.5小時(shí)后，大鼠深麻醉下經(jīng)心臟用0

6、.9％生理鹽水和4％多聚甲醛溶液各50 ml灌流固定，完整取出腦組織，冠狀切取前囟部位3～13mm的組織，浸入4％多聚甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩Ｖ缶凭撍?，二甲苯透明，浸蠟，包埋，連續(xù)冠狀切片(片厚5 μm)，用抗NMDAR1多克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色(ABE法)。在右側(cè)海馬CA1區(qū)相同部位分別取4個(gè)相鄰的40倍視野，以胞漿或胞核染成棕黃色作為陽性細(xì)胞，計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)以(-x)±s表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)

7、行方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有顯著性。 2.2 海馬CA1區(qū)谷氨酸和GABA濃度的檢測利用柱前衍生高效液相色譜-熒光法測定出各種濃度的谷氨酸和GABA標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、求得回歸方程。利用該方法測出每個(gè)樣品中上述兩種氨基酸的峰面積，根據(jù)回歸方程求得氨基酸的濃度。 結(jié)果： 1.各組間體重、心率、微透析針置入并穩(wěn)定60 min及L組開始出現(xiàn)驚厥波時(shí)(其他兩組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn))兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)

8、比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.各組間驚厥波出現(xiàn)時(shí)間、呼吸抑制出現(xiàn)時(shí)間及持續(xù)時(shí)間的比較C組未見驚厥波，后兩組均見驚厥波出現(xiàn)，其中L組每只均見驚厥波，而MK-801組只有兩只出現(xiàn)了驚厥波。與L組比較，MK-801+L組呼吸抑制出現(xiàn)較晚，呼吸抑制持續(xù)時(shí)間較短。 3.各組間海馬CA1區(qū)NMDAR1表達(dá)的比較與C組比較，L組、MK-801+L組NMDAR1免疫陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增多；與L組比較，MK-801+L組NMDAR1免疫陽性細(xì)