利多卡因抑制膿毒癥大鼠HMGB1表達.pdf

1、一、研究背景:
　　 膿毒癥是由嚴重的感染、燒傷、創(chuàng)傷、休克、外科大手術(shù)等引發(fā)的一種全身性炎癥反應綜合癥，也是誘發(fā)多器官功能衰竭(multiple organ system failure，MOSF)、膿毒癥休克最重要的原因。雖然抗生素的廣泛應用大幅度降低了膿毒癥的死亡率，但近30年，膿毒癥的發(fā)病率和因膿毒癥死亡病例的絕對數(shù)字仍呈明顯的上升趨勢，膿毒癥仍然是ICU病人死亡的主要原因。據(jù)報道，全球范圍內(nèi)膿毒癥的病死率約為20％，即

2、每天約有1400人死于膿毒癥。我國危重病患者膿毒癥發(fā)病率約為15.7％，病死率更是高達30.6％。因此，膿毒癥已成為繼心血管疾病、癌癥之后威脅人類健康的第三位疾病。為此，危重醫(yī)學界共同呼吁采取措施降低膿毒癥的病死率。
　　 研究表明，高遷移率族蛋白(high mobility group box1，HMGB1；high mobilitygroup protein1，HMG-1；amphoterin)在膿毒癥的致死過程中發(fā)揮著關(guān)鍵

3、性炎性因子作用。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)攻擊后8～12小時RAW264.7細胞開始釋放HMGB1，釋放時間至少可持續(xù)72小時。而腫瘤壞死因子誘導的HMGB1釋放可持續(xù)達96小時，甚至更長。壞死的組織細胞，甚至凋亡細胞也可將內(nèi)含的HMGB1釋放至細胞外。HMGB1一旦進入組織間隙，即可表現(xiàn)出其炎癥因子的作用。HMGB1可通過自身毒性作用、刺激其他促炎因子釋放、導致凝血、纖溶系統(tǒng)功能紊亂、破壞血管內(nèi)皮細胞的完整

4、性、擾亂免疫系統(tǒng)功能、破壞腸黏膜屏障的完整性等多種途徑參與或加重膿毒癥的致病過程。研究表明，即使在致病因素作用后24小時使用抗HMGB1抗體、HMGB1的A盒或丙酮酸等針對HMGB1進行處理，均可顯著提高膿毒癥動物的生存率。正是由于HMGB1延遲合成與分泌的特點及其廣泛的致病作用，HMGB1被認為是膿毒癥致病的關(guān)鍵性因子，并可能為膿毒癥的治療帶來新的突破。
　　 已有的研究顯示，利多卡因可作用于炎癥反應的多個方面，對炎癥過程發(fā)揮

5、調(diào)節(jié)作用。特別是其對免疫功能調(diào)節(jié)作用的存在，吸引研究者在多種疾病及其模型上對利多卡因的治療作用進行試驗性研究，并取得較好的治療效果。利多卡因凝膠可使?jié)冃灾苯Y(jié)腸炎患者臨床癥狀明顯改善，腸道組織學改變亦有顯著的減輕。利多卡因膀胱沖洗可顯著改善間質(zhì)性膀胱炎患者膀胱間質(zhì)的水腫，促進膀胱壁潰瘍的愈合，改善臨床癥狀。利多卡因還可顯著降低燒傷病人血清炎性因子的水平，同時病人疼痛程度也明顯減輕。在心、肝、腎缺血再灌注損傷、高氧或內(nèi)毒素肺損傷研究中也有

6、類似的發(fā)現(xiàn)。在LPS誘導的膿毒癥模型中，提前1小時開始連續(xù)3小時的利多卡因靜脈輸注可顯著降低動物病死率。另一項CLP小鼠膿毒癥模研究中，預先使用微量滲透泵連續(xù)皮下輸注利多卡因也有類似的結(jié)果。多數(shù)報道認為，利多卡因的抗炎作用與其下調(diào)NF-κB，抑制TNF-α，IL-1β等早期炎癥因子有關(guān)。但是，利多卡因抗炎/抗膿毒癥作用與HMGB1的關(guān)系尚明確。
　　 RAW264.7細胞是小鼠單核巨噬細胞株。研究發(fā)現(xiàn)，LPS或IFN-γ刺激下R

7、AW264.7細胞分泌HMGB1的水平與人外周血單核細胞相似。因此，本研究我們首先以RAW264.7細胞為研究對象，在細胞水平觀察利多卡因?qū)PS誘導的RAW264.7細胞HMGB1釋放的影響。然后，以Wistar大鼠為研究對照，使用盲腸結(jié)扎穿孔的方法制作膿毒癥動物模型，并將不同劑量的利多卡因(5，10，20mg/kg)在CLP后0，1，2小時腹腔內(nèi)注射，觀察利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠肝、腎組織內(nèi)HMGB1表達的影響，進一步在動物整體水平探討

8、利多卡因抗炎/抗膿毒癥的機制。最后直接采用純化重組HMGB1制作動物模型，觀察利多卡因在整體動物水平和器官水平對HMGB1直接致?lián)p動物的保護作用。
　　 二、方法
　　 1、細胞實驗：RAW264.7細胞以5×106個/ml的密度種植在96孔組織培養(yǎng)板中。取生長狀態(tài)良好的細胞，分為5組，每組5孔。具體操作：除去含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)液，無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3遍，(1)陰性對照組(C組)僅加入無血清的R

9、PMI1640培養(yǎng)液1ml；(2)陽性對照組(LPS組)加入內(nèi)含100ng/ml LPS的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液1ml；(3)利多卡因1組加入內(nèi)含2μg/ml利多卡因和100ng/ml LPS復合液1ml；(4)利多卡因2組加入內(nèi)含20μg/ml利多卡因+100ng/ml LPS復合液1ml；(5)利多卡因3組加入內(nèi)含200μg/ml利多卡因+100ng/ml LPS復合液1ml。5組細胞均于孵育箱中培養(yǎng)24h后收取培養(yǎng)上清和

10、細胞。ELISA測定上清液HMGB1水平，PCR測定細胞內(nèi)HMGB1 mRNA表達，ActiveMotif NF-κB家族試劑盒測定NF-κB。
　　 2、動物實驗：2％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉動物。假手術(shù)組(Sham組，n=15)打開腹腔后縫合，其他各組制作盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥模型。術(shù)后0、1、2小時Sham組和生理鹽水處理組(NS組，n=20)分別腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml，利多卡因各組(n=15)分

11、別注射利多卡因5、10和20mg/kg(用生理鹽水稀釋至0.5ml)。24小時后過量麻醉劑處死動物，留取血液和器官標本。實時PCR測定器官HMGB1 mRNA表達，免疫組化檢測定器官NF-κB p65，光學多顯微鏡檢查組織病理變化，全自動生化分析儀測定血漿ALT、Cr，ELISA測定肺MPO和小腸MDO。另取100只動物分4組進行7天生存率觀察，制作Kaplan-Meier生存率曲線，Log-rank法進行生存率比較。
　　 3

12、：HMGB1直接損傷實驗C3H/HeJ小鼠30只，分3組(n=10)：對照組(C組)、HMGB1組(H組)和利多卡因組(L組)。2％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉動物。C組腹腔注射生理鹽水1ml；H組，腹腔內(nèi)注射高純度人工重組HMGB1(rHMBG-1)500μg/1ml；L組接受H處理后0、1、2小時腹腔內(nèi)利多卡因20mg/kg(用生理鹽水稀釋至0.5ml)。進行生存率觀察。另取C3H/HeJ小鼠30只，分3組(n=10)：對

13、照組(C組)、HMGB1組(H組)和利多卡因組(L組)。2％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉動物。C組氣管內(nèi)注射生理鹽水50μl；H組氣管內(nèi)注射rHMBG-1100μg/50μl；L組接受H處理后0、1、2小時腹腔內(nèi)利多卡因20mg/kg。觀察氣管灌洗液中性粒細胞比和蛋白含量、肺濕干重比、肺組織MPO活性、肺組織TNF-a水平、NF-κB蛋白含量和肺病理改變。
　　 4：統(tǒng)計學處理：組間比較使用多參數(shù)單因素方差分析(Hol

14、m-Sidak method)檢驗。生存率比較Log-rank檢驗進行。數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包或SigmaPlot11.0處理并作圖。P<0.05，認為差別有統(tǒng)計學意義。
　　 三、結(jié)果
　　 1、細胞實驗：ELISA顯示，利多卡因處理可抑制LPS誘導的RAW264.7細胞HMGB1的釋放，且呈明顯劑量依賴性。與LPS組(3.18±0.527 ng/ml)比較，利多卡因20、200μg/ml組上清液HMGB1

15、水平(1.81±0.391 ng/ml，1.66±0.238 ng/ml)明顯降低(t=4.640；t=5.148，P<0.001)。免疫細胞化學顯示，正常培養(yǎng)組RAW264.7細胞胞漿內(nèi)沒有HMGB1特異性染色或淡染；LPS刺激可使巨噬細胞體積增大，偽足伸出，部分細胞胞核染色變藍，胞漿HMGB1特異性染色加深；利多卡因組細胞體積和形態(tài)改變不明顯，部分細胞HMGB1的釋放被抑制，胞漿內(nèi)HMGB1特異性染色淺。PCR觀察到利多卡因抑制細胞

16、內(nèi)HMGB1mRNA表達，與LPS組(44.44±5.82ng/ml)比較，利多卡因20μg/ml組(27.91±6.88ng/ml)、利多卡因200μg/ml組(19.34±2.71ng/ml)組HMGB1 mRNA表達水平均顯著降低(t=4.489，P=0.001；t=5.784，P<0.01)。同時，利多卡因處理也可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞NF-κB活性增強(P<0.05)。
　　 2、動物實驗：
　

17、　 1)提高動物生存率：CLP術(shù)后12小時開始部分動物活動減少，不能自潔；嗜睡，對外界環(huán)境改變失去興趣；豎毛；飲水減少。隨著的時間的延長，動物出現(xiàn)呼吸急促、腹瀉；甚至仰臥；死亡。表現(xiàn)膿毒癥模型復制成功。CLP術(shù)后第5天生理鹽水組(NS)膿毒癥大鼠全部死亡(n=25)，利多卡因5、10、20 mg/kg處理組術(shù)后第7天仍有部分動物存活。Log-rank分析顯示，利多卡因5，10，20mg/kg組大鼠生存率與生理鹽水組間比較存在統(tǒng)計學意義

18、的差異(X2=5.472，P=0.19；X2=12.859，P<0.001；X2=26.237，P<0.001)。X2
　　 2)改善器官功能：CLP各組術(shù)后24小時ALT水平較假手術(shù)組(41.60±7.89U/l))升高(P<0.05)。利多卡因10、20 mg/kg處理組(71.20±8.76 U/l，58.00±10.37U/l)與NS組(92.00±13.38U/l)存在統(tǒng)計學意義上的差異(t=3.162，P=0.005

19、；t=5.168；P<0.001)。CLP各組術(shù)后24小時血Cr水平較假手術(shù)組(20.40±5.32μmol/l))升高(P<0.05)。利多卡因5、10、20 mg/kg處理組(44.80±3.7μmol/l，34.80±4.44μmol/l，27.40±2.30μmol/l)大鼠術(shù)后24小時血Cr水平較生理鹽水組(51.00±5.00μmol/l)降低，且差異有統(tǒng)計學意義(t=2.285，P=0.033；t=5.971，P<0.00

20、1；t=8.699，P<0.001)。CLP各組術(shù)后24小時肺組織MPO活性較假手術(shù)組(4.602±0.719)升高(P<0.05)。利多卡因10、20 mg/kg處理組(6.854±0.248，6.327±0.321)與NS組(8.945±0.317)存在統(tǒng)計學意義上的差異(t=8.099，P<0.001；t=10.143，P<0.001)。CLP各組術(shù)后24小時回腸組織DAO水平較假手術(shù)組(0.849±0.113)降低(P<0.05

21、)。利多卡因10、20 mg/kg處理組(0.418±0.066，0.521±0.048)與NS組(0.192±0.052)存在統(tǒng)計學意義上的差異(t=5.136，P<0.001；t=7.466，P<0.001)。
　　 3)減輕組織病理損傷：CLP24小時肝、腎、肺和小腸出現(xiàn)廣泛的組織學損傷和炎癥細胞浸潤，利多卡因(20mg/kg)處理可明顯減輕組織學損傷和炎癥細胞浸潤。
　　 4)抑制器官HMGB1過表達和NF-κB

22、活化；實時PCR和免疫組化顯示，利多卡因可劑量依賴性的抑制CLP誘導的肝、腎、肺和小腸組織HMGB1mRNA的過表達和NF-κB的活化。
　　 3：HMGB1直接損傷實驗rHMBG1500μg腹腔內(nèi)注射2小時內(nèi)動物出現(xiàn)明顯的內(nèi)毒素血癥樣表現(xiàn)，48小時動物80％死亡，利多卡因處理組死亡率為20％。Log-rank分析顯示，利多卡因處理可顯著提高大鼠生存率(X2=4.736，P=0.03)。在rHMBG1100μg急性肺損傷實驗觀察

23、到：與對照組比較，HMGB1組、利多卡因組支氣管灌洗液中性粒細胞比和蛋白含量顯著增加，肺組織濕干重比、肺髓過氧化物酶活性、NF-κB和TNF-a蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與HMGB1組比較，利多卡因處理組上述指標均明顯降低(P<0.05)。
　　 四、結(jié)論
　　 利多卡因抗炎/抗膿毒癥作用可能與其抑制LPS誘導的巨噬細胞HMGB1mRNA合成、轉(zhuǎn)位與釋放，調(diào)節(jié)NF-κB活化有關(guān)；利多卡因腹腔內(nèi)注射可抑制CL