脂質(zhì)體介導(dǎo)起搏通道HCN2基因在哺乳動物細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、本文研究目的：脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒hHCN2/pcDNA3轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，包括人胚腎細(xì)胞(humallembryonickidneyepithelialcell,HEK293)和乳鼠心肌細(xì)胞，研究在HEK293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)后的hHCN2通道電流(IhHCN2)特點，并研究胺碘酮對IhHCI,12的急性作用；研究乳鼠心肌細(xì)胞起搏電流(1f)及其基因表達(dá)情況，觀察起搏電流阻斷劑ZD7288和Cs+對乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動的影響，以及質(zhì)粒hHCN

2、2/pcDNA3瞬時轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞后對其自發(fā)性搏動的影響，探討If在乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動的作用，為緩慢心律失常的生物起搏基因治療提供依據(jù)。 方法：質(zhì)粒hHCN2/pcDNA3轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09,以中量質(zhì)粒抽提試劑盒提取、純化。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)hHCN2/pcDNA3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，加入G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選，獲得穩(wěn)定的G418抗性的HEK293細(xì)胞系，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IhHCN2的電生理特點以及胺碘酮對IhHCN2

3、的急性作用，RT-PCR及westernblot檢測hHCN2通道的mRNA和蛋白表達(dá)情況。分離、培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒hHCN2/peDNA3轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞，利用膜片鉗技術(shù)、RealtimePCR及Westernblot檢測轉(zhuǎn)染前后乳鼠心肌細(xì)胞的起搏電流及其HCN．mRNA表達(dá)，觀察起搏電流阻斷劑ZD7288和Cs+以及起搏通道基因hHCN2轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞對乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動的影響。 結(jié)果： 1．脂質(zhì)

4、體轉(zhuǎn)染法將hHCN2基因?qū)際EK293細(xì)胞，瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選的HEK293細(xì)胞用膜片鉗技術(shù)記錄到超極化內(nèi)向電流hHCN2，．80mV～-90mV開始激活，激活緩慢，沒有明顯失活過程，呈電壓、時間依賴性激活。RT-PCR和Westernblot明顯檢測到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞有hHCN2mRNA和蛋白表達(dá)。 2．細(xì)胞外液K+濃度為30mM時，IhHCN2的反轉(zhuǎn)電位17_3mV(艫10)，PNa／PK為0．24；降低外液Na

5、+濃度和K+濃度，IhHCN2電流密度減小；測試電位一140mV時，0．5gmol／L、5gmol／L、101．tmol／L、251．tmol／L、50gmol／L、100gmol／LZD7288降低IbHCN2峰值電流分別n．6±3．6％、22．1±7．7％、37．8±10．8％、62．1±5．2％、83．2±8．0％和99．5±O．8％，濃度反應(yīng)曲線預(yù)測的半效抑制濃度(IC50)為23．9±5．9]．tmol／L，在沖洗后ZD728

6、8抑制作用不能恢復(fù)；測試電位一140mV，1gmol／L、101．tmol／L、100gmol／L、1000gmol／L、100001．tmol／LCs+降低IhHCN2峰值電流分別0．8±O．3％、12．14-4．7％、44．9±4．2％、87．1±5．5％和99．3±O．3％，濃度反應(yīng)曲線預(yù)測的半效抑制濃度(IC50)為126．8±27．1[tmoVL。沖洗后Cs+抑制作用迅速恢復(fù)；100gmol／LcAMP灌流，IhHCN2無明顯

7、變化，電極內(nèi)液中加入終濃度為100gmol／L的cAMP，IhHCU2激活加快，激活時間加快，Vm為一86+2mV，向正向移動12mY(n=8，p<0．05)。 3．以0．011xmol／L、O．1pmol／L、1gmol／L、10gmol／L、100gmol／L胺碘酮降低Ih．cs2峰值電流分別4．6±1．8％、u．4-t-63％、39．6±4．1％、78．8±3．4％和83．7±2．4％，濃度反應(yīng)曲線預(yù)測的半效抑制濃度(IC

8、50)為1．21±0．23gmol／L，10gmol／L胺碘酮灌流使各鉗制電壓下Ih~cS2激活緩慢，在測試電壓一140mV時，激活時間常數(shù)由189±38ms延長為320±57ms(艫5,p<0．05)，胺碘酮可阻滯IhHCN2，沖洗后抑制作用無明顯恢復(fù)。 4．培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在第3～10d細(xì)胞形態(tài)、搏動良好，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在82％(27／33)乳鼠心肌細(xì)胞中可以記錄到起搏電流(If)，乳鼠心肌細(xì)胞膜電容15±2pF(n：20)

9、，If在．80mV左右激活，Vm為87±6mV，電流密度18~7pA／pF(n=6，電壓140mY)．5mMCs+可以阻斷超極化內(nèi)向電流，實時定量PCR檢測乳鼠左心室心肌HCN2和HCN4基因的mRNA表達(dá)，HCN2：HCN4為5．56±L3。 5．起搏電流阻斷劑20μMZD7288和lmmCs+可以抑制乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動，分別使乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動頻率降低28％、36％。 6．轉(zhuǎn)基因乳鼠心肌細(xì)胞有hHCN2的mR

10、NA和蛋白表達(dá)，對照組乳鼠心肌細(xì)胞沒有檢測到。hHCN2/pcDAN3轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞3d后，其自發(fā)性搏動頻率為103+14次／分鐘，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3的對照組為65+15次／分鐘(n=12,p<0．01)。 結(jié)論： 1.脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒hHCN2/pcDNA3瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞成功，獲得了持續(xù)表達(dá)hHCN2通道的HEK293細(xì)胞株，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染的通道電流相類似，建立了研究克隆離子通道結(jié)構(gòu)與功能的模型。

11、 2．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的IhHCN2具有天然If特點，為超極化激活、cAMP直接激活、Na+／K*通透，起搏電流阻斷劑Cs+、ZD7288可以阻斷IhHCN2。 3．胺碘酮明顯抑制hHCN2，為治療器質(zhì)性心臟病患者心律失常提供新理論依據(jù)。4．起搏電流阻斷劑ZD7288和Cs+可以抑制乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動，起搏通道基因hHCN2瞬時轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞可以使乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動頻率增加，提示If是乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動