喉癌中ZNF403基因表達異常及其機制研究.pdf

1、喉癌 (Laryngeal carcinoma)是一種常見的上呼吸道惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的1％-8.4％，病理分型93％-99％為鱗狀細胞癌。其發(fā)生發(fā)展是一個多步驟的過程，涉及多個相關基因結構和表達調控的改變。如：Ras、 c-Myc、EGFR、Cyclin D1等瘤基因的擴增；抑瘤基因p53，Rb的突變。Cyclin D1是參與調控G1/S期檢測點的重要蛋白之一，其功能是促進細胞由G1期向S期轉化。如果Cyclin D1過量表達

2、，將使細胞G1期縮短，導致細胞分化不足。Cyclin D1在多種實質性腫瘤表達增高，是多種頭頸部鱗癌的分子標志。研究表明，Cyclin D1在喉癌組織表達量要明顯高于正常粘膜，并且與病人生存率及病理分型具有明顯的相關性。ZNF403又名DIF-3，可以在轉錄和表達水平抑制Cyclin D1的表達。該基因定位于人染色體17q12，位于17q12～21.1上的雜合性丟失的高頻區(qū)域。編碼697個氨基酸的具有指狀結構域的蛋白。本實驗室前期研究發(fā)

3、現ZNF403 mRNA在喉癌組織中表達下調，可能與喉癌的發(fā)生相關。本研究擬從以下兩個方面探討ZNF403基因在喉癌組織中表達異常的機制。 1．多種腫瘤細胞系及喉癌組織中ZNF403 mRNA的表達分析 為了分析ZNF403是否與喉癌相關，我們選取了染色體17q存在缺失，突變和擴增的腫瘤細胞系和30例喉癌及配對的癌旁正常組織，采用半定量RT-PCR方法檢測ZNF403 mRNA的表達。結果發(fā)現：喉癌細胞系Hep-2中ZN

4、F403 mRNA的表達較其他腫瘤細胞低，而在30例喉癌及配對癌旁正常組織中有18例在喉癌組織中表達明顯下調，另有2例在喉癌及配對癌旁組織中均檢測不到ZNF403 mRNA的表達。ZNF403 mRNA在喉癌組織的表達下調與患者的年齡，TNM分期無關(p>0.05)。 2 喉癌細胞系Hep-2及喉癌組織中ZNF403基因表達下調原因分析 為了分析ZNF403基因在喉癌組織中ZNF403基因表達下調機制，我們首先選取了位于

5、染色體17q12的三個STS(WI22201，WI16428，RH78009)，其中WI16428位于ZNF403基因3′-UTR。WI22201，RH78009分別位于WI16428上下游。采用PCR-變性聚丙烯酰氨凝膠電泳的方法檢測了30例喉癌及配對的癌旁正常組織中這3個位點的雜合性丟失(LOH)情況(若等位基因為純合子，則記為無信息)。結果發(fā)現，30例喉癌組織中有3例在W116428位點出現LOH (3/28)，2例在RH

6、78009位點出現LOH(2/29)，無一例在WI22201位點出現LOH，但1例發(fā)生純合性丟失。在發(fā)生LOH的喉癌組織中均出現ZNF403 mRNA的下調，但由于喉癌中LOH的頻率較低，不能完全說明喉癌組織中ZNF403 mRNA下調的原因，提示LOH可能不是引起喉癌中ZNF403基因異常表達的主要因素。 隨后，我們通過生物信息學分析和熒光素酶報告基因實驗證實，ZNF403基因啟動子區(qū)域位于開放閱讀框起點上游-1370至-607bp

7、。該序列長764bp，富含CG。我們檢測了30例喉癌及配對癌旁組織ZNF403基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況，結果顯示：喉癌組織中ZNF403基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化率為83％(25／30)，在配對癌旁組織中的甲基化率為46.7％(14/30)，喉癌組織中ZNF403基因啟動子區(qū)甲基化率明顯高于癌旁組織(P<0.001)，提示喉癌組織中ZNF403基因表達下調可能與其啟動子的DNA甲基化相關。 為了進一步分析ZNF403基因

8、啟動子區(qū)高甲基化與ZNF403基因mRNA表達的相關性，我們用甲基轉移酶抑制劑5-雜氮-2-脫氧胞苷處理的Hep-2細胞，通過RT-PCR和甲基化特異性PCR分別檢測處理前后Hep-2細胞中ZNF403 mRNA的表達情況及其基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。結果顯示：Hep-2細胞經不同濃度的5-雜氮-2-脫氧胞苷處理24h后，ZNF403表達量逐漸上升。在1uM濃度處ZNF403表達量最高；同時發(fā)現，Hep-2細胞經5-Aza處理24h后，