TRIM24在喉癌中的表達及其作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　喉癌(laryngeal carcinoma)為原發(fā)于喉部的惡性腫瘤，其病理類型以鱗狀細胞癌為主，男性多發(fā)，喉癌的病因及發(fā)病機制目前尚不明確，一般認為與吸煙、飲酒、病毒感染、環(huán)境及放射線等因素有關(guān)。我國是喉癌高發(fā)地區(qū)，北方發(fā)病率較南方高，東部地區(qū)高于西部。目前喉癌的治療以手術(shù)為主，放療及化療為輔。接受系統(tǒng)治療的早期喉癌患者預(yù)后尚可，但晚期預(yù)后不佳。喉有著重要的生理功能，包括發(fā)音、呼吸、吞咽等，因喉癌行喉部手術(shù)治療后，喉

2、功能將因手術(shù)導(dǎo)致不同程度的損傷，嚴重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量，也給社會帶來沉重的負擔(dān)。目前已發(fā)現(xiàn)多個基因與喉癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其發(fā)病的病理分子機制仍不清楚，探討其發(fā)生發(fā)展的分子機制對喉癌的診斷、治療以及預(yù)防等方面都具有重要意義，隨著近年分子生物學(xué)研究的快速進展，通過基因靶點等方法治療喉癌將為患者帶來新的希望。
　　TRIM24(tripartite motif24)是TRIM家族重要成員之一，也是泛素蛋白連接酶E3家族成員，其

3、編碼基因位于7號染色體q32-q34，氨基端依次連接三種重要的結(jié)構(gòu)域，分別為1個RING結(jié)構(gòu)域、2個B-box結(jié)構(gòu)域和1個coil-coiled結(jié)構(gòu)域，羧基端連接保守的PHD和Bromo結(jié)構(gòu)域。TRIM24因其具有典型的RING結(jié)構(gòu)域，使其具備E3連接酶的功能，如它可以結(jié)合并介導(dǎo)p53的泛素化降解。TRIM24又名轉(zhuǎn)錄中介因子1α（transcriptional intermediary factor1α，TIF1α），在細胞核內(nèi)，它可

4、以通過配體的形式與多種核受體相互作用，包括雌激素、維甲酸和維生素D3受體等。目前，已有多篇文獻報道TRIM24在肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、膀胱癌等多種腫瘤組織中存在高表達，并且與腫瘤惡性進展和不良預(yù)后呈正相關(guān)，但在喉癌中尚未見報道。
　　本研究旨在檢測TRIM24蛋白在喉癌中的表達情況和其與臨床病理因素的相關(guān)性，并通過細胞實驗探討TRIM24在喉癌細胞中的生物學(xué)功能，研究其對喉癌細胞增殖及侵襲能力影響及機制。
　　方

5、法：
　　喉癌組織標本來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，喉癌及癌旁標本來自2010年9月至2015年8月就診于我院耳鼻咽喉科行喉癌手術(shù)治療的患者。所有患者術(shù)前均未接受過任何放射治療及化學(xué)治療。標本分別進行福爾馬林固定石蠟包埋和-80℃低溫保存。石蠟包埋的喉癌組織及癌旁組織切片后進行常規(guī)的HE染色，分別由2名醫(yī)生依據(jù)2005年WHO病理診斷標準診斷，之后進行免疫組化檢測。-80℃冰凍保存的標本進行real-time PCR及wester

6、n blot檢測，使用統(tǒng)計學(xué)方法分析臨床病理資料與TRIM24表達間的關(guān)系。Hep2細胞由中國醫(yī)科大學(xué)遺傳教研室惠贈，使用含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％的CO2、飽和濕度，使用質(zhì)粒(OriGene)轉(zhuǎn)染上調(diào)TRIM24在Hep2細胞中的表達，通過siRNA(ThermoFisher，Lafayette，CO，USA)下調(diào)TRIM24的表達。通過CCK8細胞增殖實驗、細胞平板克隆實驗及transwell侵襲

7、實驗驗證TRIM24表達情況對Hep2細胞的增殖和侵襲能力的影響。采用western blot方法檢測被轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)p-AKT、cyclin D1、Bcl-2、MMP-2等表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果表明TRIM24在晚期喉癌組織中表達量明顯升高(12/16);western blot檢測發(fā)現(xiàn)28例新鮮中晚期喉癌標本中，TRIM24蛋白在喉癌組織中高表達(25/28)，real-time PCR實驗結(jié)果表明28

8、例新鮮中晚期喉癌標本中，TRIM24mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(23/28);
　　2、轉(zhuǎn)染Hep2細胞可以獲得TRIM24蛋白表達的改變，pCMV6-TRIM24質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使Hep2細胞中TRIM24高表達;siRNA干擾使Hep2細胞中TRIM24的表達量下降;
　　3、CCK8細胞增殖實驗、細胞克隆形成實驗及transwell細胞侵襲實驗表明TRIM24高表達時Hep2細胞的增殖及侵襲能力增強;
　　4、高表達TRIM2

9、4使Hep2細胞中p-AKT、cyclin D1、Bcl-2及MMP-2的表達水平升高。
　　結(jié)論：
　　1、在喉癌組織中，TRIM24 mRNA、蛋白表達水平均升高，其表達水平與臨床分期正相關(guān)。
　　2、在中晚期喉癌中TRIM24表達水平升高明顯，其在喉癌的惡性進展中發(fā)揮重要作用;
　　3、TRIM24高表達的pCMV6-TRIM24-Hep2細胞具有更強的增殖能力和侵襲能力;
　　4、TRIM24對He