TRIM24在肝細胞癌中表達的研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌是世界第五大最常見的腫瘤，全球每年約有100萬人罹患此病以及因此病死亡。盡管有關原發(fā)性肝癌的分子生物學特性以及其發(fā)生發(fā)展機制研究繁多，以及診斷技術的顯著進步與外科治療水平的提高，但原發(fā)性肝癌患者的預后仍然不太理想。原發(fā)性肝癌外科手術切除后5年復發(fā)率仍高達65％以上，轉移復發(fā)是影響原發(fā)性肝癌預后的主要因素之一，因此，研究HCC的分化增殖及復發(fā)轉移傾向的分子機制，對HCC的病程進展、預后評估有重要意義。近年來，多項研究表明，

2、TRIM24（也稱作Tif1α）作為TRIM(tripartite motif)家族重要成員之一，參與了細胞凋亡、周期調控等重要的生命過程，高表達于多種腫瘤細胞，與腫瘤的分化、增殖及發(fā)生發(fā)展有密切關系，但是在小鼠的肝癌研究中，它是一個肝臟特有的腫瘤抑制因子。然而在人類的HCC中，還沒有任何關于TRIM24蛋白表達情況及其與臨床病例參數(shù)關系研究的報道。本研究采用免疫組化技術檢測肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，H

3、CC)患者中腫瘤組織及非癌組織中TRIM24蛋白的表達情況，并分析TRIM24蛋白的表達與患者臨床病理特征之間的關系。采用siRNA干擾技術轉染HepG2干擾TRIM24的表達，檢測轉染前后TRIM24蛋白、細胞凋亡相關蛋白、細胞周期蛋白與EMT相關蛋白表達的變化情況以及采用流式細胞儀檢測干擾TRIM24對細胞凋亡及細胞周期的影響，體外研究TRIM24在HCC的發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為HCC的臨床診斷、病程進展和預后評估提供新的線索。<

4、br>　　 方法：⑴收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院肝膽外科2010年11月～2012年7月接受手術治療的HCC患者的組織標本，標本均在離體2小時內取材固定，術后均經(jīng)病理學檢查證實。⑵采用免疫組化技術檢測83例HCC患者的癌組織以及相對應的非癌組織中的TRIM24蛋白的表達，并進一步分析癌組織中的TRIM24蛋白表達與臨床病理特征的關系。⑶采用熒光定量PCR檢測LO2及五種不同侵襲轉移潛能的肝癌細胞株HepG2、SMCC-7721、97L、9

5、7H、HCCLM3中TRIM24mRNA的表達情況，篩選出靶細胞。⑷采用siRNA干擾技術轉染肝癌細胞株HepG2干擾TRIM24表達，收集細胞進行蛋白提取及流式細胞檢測。⑸Western Blot檢測轉染前后TRIM24蛋白表達以及細胞凋亡、細胞周期與EMT相關蛋白表達情況。流式細胞周期檢測轉染前后細胞周期變化;流式細胞凋亡檢測細胞轉染前后凋亡情況。⑹統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，TRIM24在癌組織和

6、非癌組織中蛋白陽性表達率的比較，以及在不同臨床病理特征情況下TRIM24在癌組織中的陽性表達率的比較均采用Pearson Chi-Square檢驗。HCC患者臨床預后的影響因素分析采用Cox多因素回歸分析。TRIM24的蛋白與患者術后無瘤生存期的關系采用生存分析（Kaplan-Meier曲線，log-rank法）。熒光定量PCR的實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT進行處理，每個樣本重復實驗進行3次實驗，計算各樣本平均CT(threshold cy

7、clenumber)值和ΔCT值(ΔCT=CT TRIM24-CTGAPDH)，計算2-ΔΔCt（ΔΔCT=ΔCT目的-ΔCT對照），其數(shù)值表示目的表達值相對于對照表達值的相對倍數(shù)，計量資料以(X)±SD表示。LO2及五種不同侵襲潛能肝癌細胞株TRIM24 mRNA的比較采用方差分析和LSD-t檢驗。細胞凋亡及細胞周期數(shù)據(jù)的比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05，采用雙側性檢驗。
　　 結果：①免疫組化檢測TRIM2483

8、例肝細胞癌組織標本中的表達，結果顯示:TRIM24在癌組織中表達陽性51例(51/83，61.4％)，相應的非癌組織表達陽性4例(4/83，4.8％)。TRIM24的陽性表達與患者AFP水平，病理分化程度，術后復發(fā)，肝內轉移及術后無瘤生存時間相關，具體為AFP≥400ug/L患者TRIM24陽性率顯著高于AFP＜400ug/L患者(P=0.036);病理分化程度越低，TRIM24表達陽性率越高(P=0.004);TRIM24表達陽性率在

9、術后復發(fā)患者(P=0.000006)及發(fā)生肝內轉移患者(P=0.004)中顯著高于無復發(fā)及無肝內轉移者;TRIM24表達陽性的患者術后復發(fā)時間顯著低于表達陰性者(P=0.002)。單因素回歸分析結果表明肝硬化及TRIM24是影響HCC患者術后復發(fā)的獨立預后因素，Cox多因素回歸分析表明TRIM24表達陽性患者的術后復發(fā)風險是表達陰性患者的5.327倍（HR=5.327;95％可信區(qū)間2.218-12.795; P＜0.01）。Kapla

10、n-Meier生存分析顯示TRIM24陽性患者的無瘤生存率明顯低于TRIM24陰性患者(P=0.000017)，提示TRIM24表達陽性的HCC患者預后不良。②熒光定量PCR檢測細胞株中TRIM24 mRNA的表達，結果顯示:以正常人肝細胞株LO2為對照，HepG2中mRNA表達為LO2的10倍(P＜0.05)，其余肝癌細胞株與LO2無明顯差異(P＞0.05)。③Western Blot檢測轉染siTRIM24后HepG2中TRIM24

11、蛋白表達較轉染前明顯下降，細胞凋亡相關蛋白中，促凋亡因子如p53、Bax、Caspase-8表達上調，而抑凋亡蛋白Bcl-2及Survivin表達下調;細胞周期相關蛋白Cyclin D1與CDK4表達下降;而EMT相關蛋白中E-cadherin表達增多，Snail、Slug、Vimentin及β-catenin表達減少。④流式細胞檢測細胞凋亡，結果顯示:干擾TRIM24表達后細胞凋亡比例增高;流式細胞檢測細胞周期，結果顯示在抑制TRIM

12、24的表達后，細胞周期中G1期細胞比例增多(P＜0.05)，S期(P＜0.05)與G2期比例減少，表明細胞周期阻滯在G1期。
　　 結論：⑴HCC癌組織中TRIM24蛋白的表達影響HCC的生物學特性，對肝細胞癌的預后評估有一定的臨床意義。⑵siTRIM24干擾實驗表明TRIM24表達的上調在HepG2細胞中起抑制細胞凋亡的作用。⑶TRIM24可能是通過調節(jié)部分關鍵性的細胞周期蛋白對細胞周期起促進作用。⑷TRIM24可能是通過促進