Exosome內(nèi)TRIM3在胃癌進展中的作用及機制.pdf

1、目的：
　　分析及鑒定胃癌來源外泌體（exosome）的形態(tài)、直徑大小及濃度，篩選其exosome內(nèi)差異表達蛋白；明確差異表達蛋白 TRIM3在體內(nèi)外實驗中對胃癌細胞增殖和遷移的影響；探討TRIM3通過exosome傳遞到胃癌細胞后如何影響其增殖和遷移能力；本研究旨在揭示TRIM3在胃癌診斷、發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，為胃癌分子診斷與治療提供新的指標(biāo)和靶點。
　　方法：
　?。?）采用透射電子顯微鏡觀察胃癌患者和健康者血

2、清exosome，胃癌細胞和胃粘膜上皮細胞培養(yǎng)上清exosome形態(tài)、直徑大??；通過Nanosight納米顆粒分析儀對exosome的直徑及濃度進行檢測分析。
　?。?）應(yīng)用高效液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀對胃癌患者和健康者血清exosome內(nèi)蛋白進行檢測分析，篩選出差異表達的蛋白；采用ELISA及Western blot方法對胃癌患者和健康者血清exosome內(nèi)差異蛋白TRIM3進行驗證；qRT-PCR及免疫組織化學(xué)方法檢測胃癌組織及癌旁組織

3、中差異蛋白 TRIM3的表達水平；qRT-PCR及Western blot方法檢測胃癌細胞及其培養(yǎng)上清中差異蛋白TRIM3的表達水平。
　　（3）構(gòu)建TRIM3表達載體、設(shè)計TRIM-siRNA干擾片段實現(xiàn)TRIM3的過表達/干擾；平板克隆形成實驗觀察TRIM3過表達/干擾對胃癌細胞增殖的影響及干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2和OCT4的變化；Transwell實驗觀察TRIM3過表達/干擾對胃癌細胞遷移能力的影響及 EMT相關(guān)指標(biāo)的變化；

4、體內(nèi)實驗觀察 TRIM3過表達/干擾對裸鼠皮下瘤增殖及增殖相關(guān)指標(biāo)PCNA表達的影響，對腹腔轉(zhuǎn)移瘤中瘤組織的數(shù)量及EMT相關(guān)指標(biāo)表達的影響。
　?。?）使用CM-Dil染料對exosome進行染色與胃癌細胞共孵育，激光共聚焦顯微鏡及流式成像儀觀察胃癌細胞對 exosome的內(nèi)化；將 TRIM3過表達的exosome作用于胃癌細胞觀察細胞增殖和遷移的變化，以及對干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2、OCT4和EMT相關(guān)指標(biāo)的影響；體內(nèi)實驗觀察TR

5、IM3過表達exosome作用的胃癌細胞對裸鼠皮下瘤及腹腔轉(zhuǎn)移瘤形成能力的影響。
　　（5）生物信息學(xué)預(yù)測靶向TRIM3的miRNA，并使用qRT-PCR技術(shù)檢測其在胃癌血清exosome及胃癌組織內(nèi)的表達水平；尋找TRIM3參與的下游重要信號通路，明確其與信號通路中重要相關(guān)分子的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　?。?）胃癌血清來源的exosome，具有典型的“碟狀”或“杯狀”形態(tài)，且濃度顯著高于健康對照組，兩組exosome的

6、直徑大小無差異；胃癌細胞培養(yǎng)上清exosome，具有典型的“碟狀”或“杯狀”形態(tài)，MGC-803、SGC-7901兩株胃癌細胞培養(yǎng)上清來源exosome的濃度較GES-1來源的exosome高，具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩株細胞培養(yǎng)上清exosome的直徑大小無差異。
　?。?）通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清與健康者血清exosome內(nèi)共存在243個差異表達的蛋白，共33個蛋白具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，其中TRIM3表達差異顯著；擴大樣本量驗證發(fā)

7、現(xiàn)胃癌患者血清exosome內(nèi)TRIM3的表達明顯低于健康人；胃癌組織中TRIM3的表達水平也較癌旁組織低；胃癌細胞及其培養(yǎng)上清exosome內(nèi)TRIM3的含量與胃粘膜上皮細胞相比顯著降低。
　　（3）TRIM3過表達可以抑制胃癌細胞在體外的增殖和遷移，使干細胞轉(zhuǎn)錄因子表達減弱，抑制EMT發(fā)生；抑制胃癌細胞在體內(nèi)的增殖和遷移，腫瘤大小、體積均小于對照組，且腹腔轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量也明顯較對照組少。TRIM3干擾可以增強胃癌細胞在體外的增殖

8、和遷移能力，使干細胞轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)，促進EMT發(fā)生；可以增強胃癌細胞在體內(nèi)的增殖和遷移能力，腫瘤大小、體積均大于對照組，且腹腔轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量也明顯較對照組增多。
　　（4）TRIM3過表達的胃癌細胞可以通過exosome傳遞大量的TIRM3到靶細胞。50μg exosome作用胃癌細胞后，能抑制胃癌細胞的增殖、遷移能力，使干細胞轉(zhuǎn)錄因子表達下調(diào)，抑制 EMT發(fā)生，E-cadherin表達上調(diào)、N-cadherin和Vimentin

9、表達下調(diào)；在體內(nèi)的增殖和遷移能力減弱，腫瘤大小、體積均小于對照組，且腹腔轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量也明顯較對照組減少。
　?。?）生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)TRIM3為miRNA-20a的直接靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_證。胃癌患者血清來源的exosome及胃癌組織內(nèi)miRNA-20a呈高表達，且與TRIM3表達水平呈負相關(guān)。TRIM3的表達變化可以影響Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt4和β-catenin分子的變化，TRIM3的

10、表達下調(diào)可以使wnt4和β-catenin的表達增強。
　　結(jié)論：
　　胃癌患者血清 exosome的濃度及 exosome內(nèi)容物與健康者有顯著差異；血清exosome和exosome內(nèi)TRIM3可能成為胃癌輔助診斷的新型標(biāo)志物；exosome攜載的TRIM3在胃癌的增殖和遷移中具有明顯的作用，且與血清miRNA-20a呈負相關(guān)；TRIM3參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。本研究為胃癌的診斷與治