胃癌中KIF26A的異常表達(dá)及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：驅(qū)動(dòng)蛋白(Kinesin)是一類馬達(dá)蛋白，利用ATP水解釋放的能量，使其自身及裝運(yùn)的貨物沿微管運(yùn)動(dòng)，參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸。此外，驅(qū)動(dòng)蛋白還參與細(xì)胞的分裂，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。目前，越來(lái)愈多的研究表明，部分驅(qū)動(dòng)蛋白在腫瘤中異常表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。KIF26A是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族的非典型成員，缺乏ATP酶活性，參與腸神經(jīng)元系統(tǒng)的發(fā)育，但其與腫瘤的關(guān)系仍未有報(bào)道。胃癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤，易發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，術(shù)后生存時(shí)間較短，嚴(yán)重危害人類健康，

2、而其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及診斷治療仍需進(jìn)一步研究和探討。
　　目的：檢測(cè)KIF26A在人體胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KIF26A的在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，研究KIF26A在胃癌組織中低表達(dá)的機(jī)制，并初步探索KIF26A發(fā)揮功能的機(jī)制。
　　方法：收集新鮮的胃癌及正常胃粘膜組織標(biāo)本，整理相關(guān)臨床資料，根據(jù)癌與非癌、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將標(biāo)本分為轉(zhuǎn)移組、非轉(zhuǎn)移組和正常組。提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄，之后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（R

3、T-qPCR）檢測(cè)各組KIF26A mRNA的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃癌石蠟標(biāo)本中KIF26A蛋白的表達(dá)，分析KIF26A與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。應(yīng)用KIF26A的小干擾RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC7901和BGC823，然后通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與浸潤(rùn)能力的改變，MTS、EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩株細(xì)胞增殖能力的改變。通過(guò)生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)可與KIF26A3'UTR結(jié)合的miRNA，并對(duì)其進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因和Wester

4、n-blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。干擾KIF26A的表達(dá)后，通過(guò)全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)，檢測(cè)差異性表達(dá)的基因，并進(jìn)行KIF26A下游信號(hào)通路分析。
　　結(jié)果：⑴實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)顯示:在胃癌組織中KIF26A的表達(dá)降低，在轉(zhuǎn)移胃癌組織中其表達(dá)進(jìn)一步降低。⑵臨床病理參數(shù)分析顯示:KIF26A的表達(dá)與胃癌的分化程度、Lauren分型、臨床分期和預(yù)后相關(guān)。KIF26A低表達(dá)，胃癌分化差，臨床分期差，術(shù)后生存時(shí)間也較短。⑶細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染KIF26

5、A干擾RNA后，其表達(dá)水平明顯降低。后續(xù)Transwell實(shí)驗(yàn)證明，干擾KIF26A后，細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)能力較對(duì)照組明顯升高。MTS及EDU實(shí)驗(yàn)顯示，抑制KIF26A，細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯變化。以上結(jié)果提示我們，KIF26A可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)。⑷上游miRNA的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證:通過(guò)Pictar、TargetScan和Miranda軟件預(yù)測(cè)作用于KIF26A3'UTR區(qū)的miRNA，通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)分析，選定4個(gè)miRNA。經(jīng)過(guò)雙熒光素

6、酶實(shí)驗(yàn)和Western-blot實(shí)驗(yàn)，證實(shí)miR-19a、miR-96與KIF26A3'UTR區(qū)結(jié)合，并且下調(diào)KIF26A的表達(dá)。⑸信號(hào)通路分析表明:KIF26A可能通過(guò)Focal Adhesion通路發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：miR-19a、miR-96與KIF26A相互作用，使其在胃癌組織中表達(dá)水平降低。胃癌組織中KIF26A蛋白的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，KIF26A高表達(dá)者生存率遠(yuǎn)高于低表達(dá)者，KIF26A的低表達(dá)可以提示預(yù)后不良。細(xì)胞