細粒棘球蚴細胞外信號調節(jié)激酶(EgERK1)基因的克隆、序列分析及功能的初步鑒定.pdf

1、目的：從細粒棘蚴（Echinococcus granulosus，Eg）中克隆細胞外信號調節(jié)激酶（EgERK1）基因，進行序列測定，生物信息學分析，構建pET28a-EgERK1原核表達質粒，經誘導、表達并純化重組rEgERK1，Western Blot檢測rEgERK1重組蛋白生物學特性，為進一步研究該基因在寄生蟲與宿主相互作用中的功能奠定基礎。方法：設計EgERK1基因特異性引物，從新疆株細粒棘球蚴中提取總RNA，RT-PCR法擴增

2、EgERK1基因，構建pMD19-T/EgERK1質粒，測序確定序列并進行生物信息學分析。構建pET28a-EgERK1原核表達質粒，測序鑒定插入序列正確性。IPTG誘導表達rEgERK1-His重組蛋白，Ni-NTA His Bind Resin親合層析柱純化，SDS-PAGE法確定蛋白表達情況，Western Blot檢測其生物學功能。結果：RT-PCR擴增出一條長度為1100bp的條帶，測序結果顯示其長度為1125bp，編碼374

3、個氨基酸，等電點為6.34，為一新基因，命名為EgERK1（EU701008）。同源性比較表明EgERK1與多房棘球絳蟲EmMPK1基因同源性為95.45%，與線蟲、酵母、果蠅和人類等ERK基因的同源性為43.04～61.88%。進化樹分析結果發(fā)現EgERK1和多房擊球絳蟲ERK基因（EmMPK1）相聚集。功能分析預測EgERK1具有ERK類激酶T-X-Y結構保守區(qū)和酶激活功能域。成功構建了pET28a-EgERK1原核表達質粒，經IP

4、TG誘導，SDS-PAGE檢測表明rEgERK1-His重組蛋白得到成功表達，在相對分子量47KDa處有表達條帶；Western Blot分析顯示rEgERK1-His重組蛋白能被特異性抗人ERK1/2單克隆抗體識別。結論：首次克隆細粒棘球蚴EgERK1新基因，成功構建高效融合表達基因工程菌株pET28a-EgERK1，成功誘導表達并純化EgERK1重組蛋白，發(fā)現EgERK1重組蛋白具有與ERK1/2抗體結合的功能，為進一步研究該基因在