MLPA技術(shù)在單基因遺傳病DMD-BMD、SMA基因診斷中的應(yīng)用.pdf

1、多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)是一種高通量、針對(duì)待測(cè)核酸中靶序列進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)具有分辨率高、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低等諸多優(yōu)勢(shì)而廣泛用于檢測(cè)人類基因組內(nèi)拷貝數(shù)變異(CNV)。近年來(lái),MLPA在技術(shù)與應(yīng)用上又有許多新的發(fā)展,如運(yùn)用化學(xué)合成法制備3’、5’探針,MLPA在基因甲基化檢測(cè)、基因表達(dá)水平分析、基因部分片段重復(fù)區(qū)域拷貝數(shù)分析及轉(zhuǎn)基因基因分型中的應(yīng)用,并且MLPA與基因芯片微陣列技術(shù)的結(jié)合,使得多重連接探針擴(kuò)

2、增真正具備了高通量檢測(cè)能力。本文就MLPA技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。
　　 背景：假肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne and Beckermuscular dystrophy,DMD/BMD)、脊髓性肌肉萎縮癥(Spinal muscularatrophy,SMA)都是常見(jiàn)的的致死性單基因遺傳病,目前暫無(wú)有效的治療手段,所以檢測(cè)患者致病基因,開(kāi)展攜帶者篩查和產(chǎn)前診斷以避免患兒的出生顯得尤為重要。傳統(tǒng)的DMD/BMD基因

3、診斷方法有缺失熱區(qū)21個(gè)外顯子.PCR檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和遺傳連鎖分析。各方法都存在一定的局限性:21個(gè)外顯子PCR檢測(cè)不能篩查雜合缺失和重復(fù)突變；實(shí)時(shí)熒光定量PCR雖能定量分析基因拷貝數(shù),但DMD基因較大,其檢測(cè)范圍難以覆蓋所有位點(diǎn),所以一般只在已知患者突變位點(diǎn)時(shí)對(duì)女性親屬相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行分析,又由于操作量大,在臨床上沒(méi)有廣泛應(yīng)用；連鎖分析篩查攜帶者依賴于患者信息,且無(wú)法區(qū)分新發(fā)生突變而誤診攜帶者。傳統(tǒng)的SMA基因診斷方法為PCR.

4、酶切法,僅限于檢測(cè)SMN1基因7號(hào)外顯子純合缺失,未能檢出攜帶者。基于上述方法的缺陷和臨床需要,我們急需建立高效、準(zhǔn)確、靈敏并適用于臨床大樣本檢測(cè)、不依賴患者信息的攜帶者篩查平臺(tái),完善DMD/BMD、SMA基因診斷體系。
　　 目的：建立單基因遺傳病DMD/BMD與SMA的多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)檢測(cè)平臺(tái),提高患者診斷率和攜帶者檢出率,并指導(dǎo)再生育。
　　 方法：①有患者參與診斷的DMD家系18個(gè),無(wú)患者信

5、息的家系11個(gè)。18位患者已檢測(cè)了突變熱區(qū)21個(gè)外顯子的缺失情況,診斷率為66.7％(12/18),且通過(guò)STR遺傳連鎖分析均可確定X風(fēng)險(xiǎn)染色體。應(yīng)用MLPA技術(shù)對(duì)29個(gè)DMD家系中5位已知缺失突變的患者、28位女性疑似攜帶者及1例胎兒行基因診斷。產(chǎn)前診斷通過(guò)SRY基因檢測(cè)確定性別。對(duì)缺失/重復(fù)型DMD攜帶者行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。②應(yīng)用MLPA檢測(cè)8個(gè)SMA家系的4位SMA患者,12位疑似攜帶者。4位SMA患者已經(jīng)PCR-酶切法篩查

6、,結(jié)果提示SMN1的7號(hào)外顯子均為純合缺失。
　　 結(jié)果：DMD:①M(fèi)LPA檢測(cè)到5位患者已知位點(diǎn)及其相鄰位點(diǎn)存在缺失突變。說(shuō)明MLPA檢測(cè)范圍廣,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。②18位DMD患者進(jìn)行了缺失熱區(qū)21個(gè)外顯子的檢測(cè),診斷率為66.7％(12/18),應(yīng)用MLPA技術(shù)后,在3個(gè)未篩查到缺失突變的DMD家系中發(fā)現(xiàn)了重復(fù)突變,DMD患者診斷率提高到83.3％(15/18)。聯(lián)合應(yīng)用MLPA檢測(cè)、缺失熱區(qū)突變篩查和遺傳連鎖分析可為18個(gè)有

7、患者參與診斷的DMD家系提供信息,診斷率達(dá)100％(18/18)。③連鎖分析需在有患者參與的前提下才能進(jìn)行攜帶者的篩查,而MLPA不依賴患者參與,即可對(duì)疑似攜帶者的致病基因行直接診斷。本研究應(yīng)用MLPA篩查到11位DMD女性攜帶者(其中5位來(lái)自無(wú)患者信息的家系),結(jié)果經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證無(wú)誤。攜帶者診斷率為50％(11/22)。④一例產(chǎn)前診斷胎兒SRY檢測(cè)為陰性,其未遺傳到母親的缺陷基因,排除攜帶者身份。⑤5個(gè)家系(家系6-10)經(jīng)

8、遺傳連鎖分析提示,患者X致病染色體均遺傳白其母親。應(yīng)用MLPA發(fā)現(xiàn)這5個(gè)家系DMD患者母親基因型正常,推知患者的缺失突變系新發(fā)生突變,突變新發(fā)生率為35.7％(5/14)。僅依靠連鎖分析篩查攜帶者有可能發(fā)生誤診,故生育指導(dǎo)時(shí),仍需對(duì)疑似攜帶者行直接基因診斷。
　　 SMA:①4位SMA患者M(jìn)LPA檢測(cè)結(jié)果:1號(hào)患者SMN1純合缺失；2號(hào)患者一拷貝SMN1缺失,另一拷貝轉(zhuǎn)變?yōu)镾MN2；3、4號(hào)患者基因型均表現(xiàn)為一拷貝SMN1裝變?yōu)?/p>

9、SMN2,另一拷貝僅7號(hào)外顯子轉(zhuǎn)變?yōu)镾MN2外顯子7。MLPA可判斷SMN1是發(fā)生了缺失還是轉(zhuǎn)換,檢測(cè)結(jié)果比PCR-酶切法更詳細(xì)。②PCR-酶切法不能篩查攜帶者,MLPA對(duì)12位SMA疑似攜帶者的SMN1/2基因拷貝數(shù)進(jìn)行了相對(duì)定量,確定了攜帶者身份,為其再生育提供了有利信息,攜帶者診斷率為100％(12/12)。③本課題發(fā)現(xiàn)了8種SMN基因型。
　　 結(jié)論：MLPA是一種高效、靈敏、準(zhǔn)確、性價(jià)比較高的DMD/BMD、SMA分子