利用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選及鑒定肺癌特異性結(jié)合多肽.pdf

1、肺癌是世界范圍內(nèi)最常見、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)兩種，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80％。由于肺癌起病隱匿，肺癌的篩查和治療方面沒有得到根本的改善，患者出現(xiàn)癥狀時(shí)多為晚期，預(yù)后較差，肺癌的5年存活率僅為13％；80％的患者在診斷后1年內(nèi)死亡。而肺癌的早期診斷患者的5年存活率可達(dá)6

2、0％～90％。因此，積極尋找肺癌早期診斷的特異性標(biāo)志物是提高肺癌治療效果的根本所在；同時(shí)，對于中晚期肺癌，加速靶向治療藥物的研發(fā)是克服當(dāng)前肺癌化療高毒、低療效的有效手段。 目的：以肺癌細(xì)胞A549為研究目標(biāo)，利用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選出與肺癌特異性結(jié)合的多肽，為肺癌的早期診斷和靶向治療奠定基礎(chǔ)。 方法：首先，我們將肺癌細(xì)胞A549 接種于裸鼠體內(nèi)，待其荷瘤成功并增殖到一定程度，采用體內(nèi)噬菌體肽庫展示技術(shù)，將肽庫靜脈注射入

3、荷瘤裸鼠體內(nèi)，然后篩選與肺癌組織特異性結(jié)合的含外源多肽的噬菌體，經(jīng)過3輪體內(nèi)篩選。然后，隨機(jī)挑取一批第3輪篩選后的噬菌體單克隆，采用ELISA及細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定噬菌體對肺癌細(xì)胞A549的親和力。挑取陽性克隆擴(kuò)增，按照分子克隆上的方法提取噬菌體單鏈DNA，送測序公司進(jìn)行序列測定，根據(jù)測序結(jié)果獲得各噬菌體外源多肽的核苷酸序列，對獲得的多肽進(jìn)行生物信息學(xué)分析。接下來進(jìn)行多肽的特異性鑒定，首先，通過化學(xué)合成多肽并標(biāo)記熒光FITC。然后，利用熒光

4、標(biāo)記多肽鑒定多肽與肺癌細(xì)胞及組織結(jié)合的特異性、親和力、體內(nèi)分布等。利用細(xì)胞免疫熒光鑒定多肽對肺癌細(xì)胞A549、NCI-H1299、肝癌細(xì)胞7402、HepG2、肺正常細(xì)胞WI-38、肝正常細(xì)胞LO2的親和力。利用組織免疫熒光鑒定多肽對肺癌組織、肺正常組織的結(jié)合。利用熒光多肽在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)鑒定多肽在荷瘤裸鼠的靶向性分布。 結(jié)果：經(jīng)3 輪體內(nèi)篩選，噬菌體在腫瘤組織中富集了104 倍。隨機(jī)挑取第3 輪篩選后的30個(gè)噬菌體單克隆

5、，分別命名為phage-1、phage-2、…，phage-30，采用ELISA 鑒定噬菌體對肺癌細(xì)胞A549的親和力，成功獲得了對A549 有較高親和力噬菌體克隆27個(gè)，其中，P/N>2.5以上的有17個(gè)克隆，而在上述17個(gè)克隆中，P/N>3.0的克隆有4個(gè)，分別是phage-1、phage-12、phage-14和phage-20，同時(shí)，細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定這4個(gè)克隆對A549的親和力，與正常對照組相比，DAB染色呈顯著陽性。將ELIS

6、A 鑒定后的P/N>2.5的噬菌體克隆共17個(gè)擴(kuò)增，測序，根據(jù)測序結(jié)果獲得噬菌體外源多肽的核苷酸序列，其中有14個(gè)噬菌體克隆分別插入了6 條不同的外源多肽核苷酸序列，分別命名為zp1，zp2，zp3，zp4，zp5,zp6，另外還有3個(gè)噬菌體克隆測序結(jié)果顯示其外源多肽序列丟失（空噬菌體）。測序結(jié)果顯示多肽zp2 重復(fù)頻率最高，達(dá)到50％，且生物信息學(xué)分析其在國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)道，其功能也屬未知，故我們擬對多肽zp2 進(jìn)行系統(tǒng)研究。通過化

7、學(xué)合成多肽zp2 全長，并標(biāo)記熒光FITC（zp2-FITC）。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，zp2-FITC 對肺腺癌細(xì)胞A549具有較強(qiáng)親和力，并且也發(fā)現(xiàn)，其對肺鱗癌細(xì)胞NCI-H1299 同樣有較強(qiáng)親和力，對肝癌細(xì)胞7402、HepG2的結(jié)合較弱，但對肺正常細(xì)胞WI-38、肝正常細(xì)胞LO2 親和力不強(qiáng)。組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，zp2-FITC對臨床肺癌組織的結(jié)合顯著高于正常對照組。裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)顯示，zp2-FITC在荷瘤裸鼠腫瘤部位分布

8、較多，有較好的靶向性，其次，在肝臟、腎臟組織也有分布，可能與其是主要的代謝器官有關(guān)，但是在裸鼠大腦、心臟、肺臟等正常組織未見及分布。 結(jié)論：(1) 成功建立了裸鼠荷瘤模型；(2) 利用上述模型，在體內(nèi)成功篩選出與肺癌組織特異性結(jié)合的噬菌體；(3) 利用ELISA和細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定出27個(gè)噬菌體單克隆對A549 有高度特異性和親和力；(4) 經(jīng)過DNA 測序，獲得了6 條多肽序列，分別命名為zp1、zp2…zp6，經(jīng)生物信息學(xué)分析