IGF-1R調控乳腺癌增殖和遷移的實驗研究.pdf

1、目的：應用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞胰島素樣生長因子1型受體（type I insulin-like growth factor receptor，IGF-1R）的表達，探討IGF-1R在乳腺癌細胞體外增殖、遷移及在乳腺癌移植瘤生長中所起的作用，并探討IGF-1R調控乳腺癌增殖和遷移的信號轉導通路。
　　 方法：構建攜帶有綠色熒光蛋白報告基因的IGF-1R s

2、hRNA質粒載體，高效轉染293T細胞，通過RT-PCR和Western blot技術分別檢測IGF-1R mRNA和蛋白表達水平，篩選沉默效率最高的shRNA表達質粒。通過脂質體法將該質粒轉染乳腺癌細胞MDA-MB-231，倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率，CCK-8法檢測細胞增殖能力，體外遷移實驗檢測細胞遷移能力。通過G418篩選IGF-1R基因沉默的細胞穩(wěn)株，接種于重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodefi

3、ciency ，SCID）小鼠乳腺脂肪墊成瘤，同時設立對照組，定期觀察腫瘤生長情況。使用小分子抑制物LY294002和PD98059分別抑制磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路和有絲分裂活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的信號轉導，并給予胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IG

4、F-1）刺激，檢測乳腺癌細胞體外增殖和遷移能力的變化。
　　 結果：成功構建IGF-1R shRNA質粒載體，并篩選出沉默效率最高的shRNA表達質粒。該質粒轉染293T細胞后，IGF-1R mRNA和蛋白表達水平明顯下降。該質粒轉染MDA-MB-231細胞的效率約為60％。使用G418篩選和有限稀釋法獲得穩(wěn)轉細胞株，其體外增殖和遷移能力受到顯著抑制（p<0.01）。成功構建SCID小鼠乳腺癌移植瘤模型，IGF-1R基因沉默組的

5、腫瘤生長明顯減慢，移植瘤的體積明顯小于對照組（p<0.01）。IGF-1干預后MDA-MB-231細胞增殖和遷移能力明顯增強（p<0.05），LY294002和PD98059對IGF-1干預下的細胞增殖和遷移均有顯著抑制作用（p<0.01）。
　　 結論：IGF-1R shRNA表達質粒能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞IGF-1R的表達，顯著抑制乳腺癌細胞的體外增殖和遷移能力。IGF-1R基因沉默的乳腺癌細胞在SCID小鼠內