豬傳染性胃腸炎M基因的克隆及序列分析.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬,其可導(dǎo)致豬傳染性胃腸炎.對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害性極大.抗毒素和抗生素等常規(guī)藥物對(duì)該病無(wú)任何治療作用,預(yù)防該病的有效方法是疫苗接種.該研究以豬傳染性胃腸炎病毒感染的乳豬小腸病料為材料,自行設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,通過(guò)套式(RT-nested)PCR及普通的RT-PCR擴(kuò)增出豬傳染性胃腸炎病毒M基因全序列,經(jīng)測(cè)序、同源性比較后,進(jìn)行深

2、入的分析,主要研究結(jié)果如下:1.該試驗(yàn)以乳豬小腸組織病料為材料,用Trizol法提取總RNA,經(jīng)甲醛凝膠變性電泳,能清晰的看到28s、18srRNA兩條亮帶以及一條較弱的5srRNA帶.結(jié)果表明,所提取的RNA完整性好,沒(méi)有發(fā)生降解,完全可以用于RT-PCR反應(yīng).2.根據(jù)GeneBank中發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒M基因序列,利用軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(外引物和內(nèi)引物),在普通的RT-PCR方法基礎(chǔ)上,建立了RT-nested PCR體系,擴(kuò)增

3、出豬傳染性胃腸炎病毒M基因的全序列,使用內(nèi)外引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度分別為1037bp、1328bp.結(jié)果表明,用雙引物的RT-nested PCR較普通的RT-PCR擴(kuò)增方法更具特異性,重復(fù)性好,能很好的避免病毒檢測(cè)時(shí)假陽(yáng)性的出現(xiàn).且較傳統(tǒng)的方法如電鏡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、ELISA等更方便可靠,完全可以作為一種新型的、特異性強(qiáng)的病毒檢測(cè)的方法.3.利用RT-PCR方法,擴(kuò)增出豬傳染性胃腸炎病毒M基因全序列,長(zhǎng)度為1 328 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)

4、回收、轉(zhuǎn)化,克隆在pGEM-T Easy載體的T位點(diǎn)上.用EcoRⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒DNA,挑選出陽(yáng)性克隆菌,進(jìn)行序列測(cè)定后.利用CLUSTAL(1.82)軟件進(jìn)行同源性分析.結(jié)果顯示,擴(kuò)增的豬傳染性胃腸炎病毒M基因序列與GeneBank中登錄號(hào)為AY587883和AF302262的豬傳染性胃腸炎病毒M基因的核苷酸序列同源性分別為97.2%,97.3%.氨基酸同源性分別為97.3%,98.0%.軟件分析表明,各有22處和21處堿基發(fā)生了