30789.花背蟾蜍晶狀體發(fā)育相關pax6variant新基因生物學特性及功能的初步研究

1、：：蘭煎!查窒亟堂焦迨塞原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：本人所呈交的學位論文，是在導師的指導下獨立進行研究所取得的成果。學位論文中凡引用他人已經發(fā)表或未發(fā)表的成果、數據、觀點等，均己明確注明出處。除文中已經注明引用的內容外，不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究成果做出重要貢獻的個人和集體，均己在文中以明確方式標明。本聲明的法律責任由本人承擔。論文作者簽名：凌壟：日期：中文摘要Pax6是眼發(fā)育過程中最重要的調控基因之一

2、。從果蠅到人類等大量物種的眼發(fā)育和晶狀體決定過程中都存在Pax6。Pax6可以形成多種蛋白亞型，如Pax6、Pax6APD和Pax6(Sa)等。已有研究表明Pax6調控作用的多樣性是由Pax6蛋白不同亞型控制的。本課題通過建立花背蟾蜍晶狀體不同發(fā)育時期的實驗模型，以鰓血循環(huán)期的胚胎為材料，采用RACE(RapidAmpliphicationofcDNAEnds)的方法，成功克隆得到花背蟾蜍Pax6variant新基因(Genebank：

3、FJl75151)。將該基因進行生物信息學分析，包括載體片段去除、基因開放可讀框COpenReadingFrame，ORF)預測、基因編碼蛋白結構域預測、同源性的分析等。與花背蟾蜍Pax6進行比對，發(fā)現二者的差異在PST域3’端，相似性為531％。PST域結構的改變可能導致反式激活功能的改變。配對盒基元序列和同源異型域這兩個主要功能區(qū)高度保守性意味著該基因在基礎發(fā)育過程中的重要作用。通過RTPCR方法獲得花背蟾蜍Pax6和Pax6var

4、iant差異部分基因序列，將其克隆到pMD18T載體上，測序正確后將其克隆至pGEX4T3融合表達載體上構建了重組質粒pGEXPax6和pGEXPax6variant。經測序后正確的重組子轉化入Rosetta(DE3)表達宿主菌中，誘導表達GSTPax6和GSTPax6variant融合蛋白。經GST親和柱層析進一步純化獲得了可溶性重組蛋白。以純化的融合蛋白GSTPax6和GSTPax6variant分別作為抗原，免疫家兔制備多克隆抗體

5、。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(EuSA)、WesternBlot檢測其抗血清的效價、靈敏度和特異性。結果表明，Pax6和Pax6variant血清效價均達到1：100000以上。應用WesternBlot初步驗證了轉錄因子Pax6從鰓血循環(huán)期到鰓蓋完全封閉期都有表達，而Pax6variant僅在鰓血循環(huán)期表達，表明Pax6在花背蟾蜍晶狀體發(fā)育過程中起了更為重要的作用。Pax6variant蛋白是一種Pax6截短蛋白，PST域3’端的因短缺而失