小麥韌皮部篩分子程序性細(xì)胞半死亡中的BEN1-LIKE蛋白和Zn2+的定位與功能初探.pdf

1、小麥（TriticumaestivumL.）穎果韌皮部篩分子(Sieve elements，SEs)的主要功能是運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)。已有研究證明，小麥穎果韌皮部篩分子發(fā)育時(shí)間在0～7DAF，期間經(jīng)歷了一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞程序性死亡過程——細(xì)胞程序性半死亡，即該程序性死亡由于多種原因中途停滯，并沒有進(jìn)行到底。其發(fā)育過程中細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生有序降解，但成熟篩分子仍保留少量細(xì)胞質(zhì)和完整細(xì)胞質(zhì)膜，仍有活性和執(zhí)行養(yǎng)分運(yùn)輸功能。目前，關(guān)于篩分子細(xì)胞程序性半死亡

2、的研究報(bào)道較少，其發(fā)育機(jī)理還有許多未知的方面。例如，篩分子發(fā)育時(shí)細(xì)胞核會發(fā)生降解，但細(xì)胞核降解過程是如何調(diào)控的？是否有某些蛋白酶參與了核降解的調(diào)控過程？這些蛋白酶的活性和相關(guān)基因的表達(dá)是否與細(xì)胞程序性死亡中止有關(guān)？為了解決上述問題，本次實(shí)驗(yàn)研究采用顯微和超微免疫組織化學(xué)定位法、原位雜交定位法和多種分子生物學(xué)技術(shù)，研究了小麥穎果韌皮部篩分子發(fā)育過程中BEN1-LIKE（大麥核酸內(nèi)切酶）蛋白和Zn2+的定位，并對Ⅱ型Metacaspase（

3、半胱氨酸蛋白酶）基因和caspase-3-like（半胱天冬酶-3）蛋白進(jìn)行了初步檢測，得到了如下主要結(jié)論:
　　1、在篩分子發(fā)育過程中，細(xì)胞核降解主要發(fā)生在2～5DAF。3DAF，細(xì)胞核開始發(fā)生明顯變形內(nèi)陷。4DAF，細(xì)胞核裂解的殘留物質(zhì)被液泡吞噬降解。在5DAF，細(xì)胞核基本被完全降解;液泡膜局部與細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生膜融合，融合區(qū)間包含了部分細(xì)胞內(nèi)含物。
　　2、小麥穎果腹部維管束組織DNA凝膠電泳結(jié)果顯示出DNAladder現(xiàn)

4、象，為PCD的典型特征。熒光定量PCR顯示，小麥穎果腹部維管束組織中兩個(gè)Ⅱ型Metacaspase基因（TeaMCAⅡ和TaMCA4）有超表達(dá)，且有相似的表達(dá)趨勢，即均在1～6DAF達(dá)到最高。Caspase-3-like蛋白的免疫組化檢測結(jié)果顯示，1DAF和2DAF的小麥篩分子中陽性信號較3～7DAF的明顯增強(qiáng)。
　　3、熒光定量PCR顯示，BEN1-LIKE基因也在小麥腹部組織中有超表達(dá)，且在3DAF達(dá)到最高;通過免疫組織化學(xué)法

5、檢測，發(fā)現(xiàn)在顯微細(xì)胞水平上BEN1-LIKE蛋白主要定位在3DAF和4DAF的韌皮部篩分子中。另外，mRNA原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)，在3DAF和4DAF，BEN1-LIKE的mRNA轉(zhuǎn)錄信號最明顯。免疫電鏡檢測進(jìn)一步在超微亞細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)BEN1-LIKE蛋白主要定位在篩分子細(xì)胞核上。
　　4、TSQ-Zn2+熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)，反映篩分子Zn2+濃度的藍(lán)色熒光信號在3DAF和4DAF時(shí)比2DAF和5DAF要強(qiáng)，表明篩分子內(nèi)源Zn2+的濃

6、度先增加后減少，該變化趨勢與BEN1-LIKE蛋白的變化有高度的的關(guān)聯(lián)性。
　　綜上所述，在篩分子發(fā)育過程中檢測到Ⅱ型Metacaspase基因（TeaMCAⅡ和TaMCA4）的表達(dá)以及caspase-3-like蛋白的定位，推測它們可能在篩分子的分化發(fā)育初期起作用。根據(jù)BEN1-LIKE蛋白的動態(tài)變化與細(xì)胞核降解的時(shí)間推測，BEN1-LIKE蛋白可能參與了篩分子發(fā)育過程中細(xì)胞核的降解。另外，由于篩分子內(nèi)源Zn2+的濃度變化與BE