柔嫩艾美耳球蟲AHFX株的鑒定及其對雞血清生化指標的影響.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳屬的一種或多種球蟲寄生于雞腸道上皮細胞內而引起的呈世界性分布的原蟲病,該病對養(yǎng)雞業(yè)危害十分嚴重。本試驗選用玻璃紙膠囊單卵囊分離技術成功分離到一株球蟲,并應用形態(tài)學和分子生物學方法進行了鑒定,最終鑒定為柔嫩艾美耳球蟲安徽肥西(AHFX)株;用所獲球蟲感染雛雞,對雛雞感染后不同階段血清生化指標的變化進行了研究。
　　首先,從安徽肥西縣某雞場選擇具有盲腸球蟲病典型癥狀的病雞,取病雞盲腸內容物研碎后加生理鹽水攪拌混勻,經(jīng)

2、40目銅絲篩和260目尼龍篩過濾,濾液經(jīng)3000r/min,離心10min,收集沉淀。向沉淀物中加入適量2.5％重鉻酸鉀,置于28℃恒溫箱內培養(yǎng)至85%以上卵囊孢子化,孢子化卵囊于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。以玻璃紙為載體,配合使用空膠囊進行球蟲單卵囊分離,先將卵囊液稀釋至每滴卵囊液中只含有1~2個卵囊,沾取一滴置于0.5cm×0.5cm的玻璃紙上,觀察卵囊的形態(tài)學特征,而后置于空膠囊內,經(jīng)口接種于20只6d齡雛雞,接種后第5d開始檢查糞樣中卵囊

3、,以判斷雛雞球蟲感染情況。
　　隨后,將上述單卵囊分離所獲后代球蟲(第一代),按1×104個卵囊/雞的劑量感染14d齡無球蟲雛雞,每日觀察雞只精神狀態(tài),食欲狀況,糞便變化。在喂服115h后,每2h檢查1次糞便,并記錄最早出現(xiàn)卵囊的時間即最短潛在期,同時用沉浮法收集球蟲卵囊(第二代),測定最短孢子化時間。分別隨機測量50個第一代與第二代球蟲卵囊,并對其大小進行差異顯著性檢驗(F檢驗)。
　　而后,漂洗、濃縮所獲卵囊液,按照常規(guī)

4、DNA抽提法進行球蟲全基因組DNA的提取。參照Yao-ChiSu等設計的引物:ET1:5'-CGCTGCTGGTTTTACAGGTT-3',ET2:5'-GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC-3'進行PCR擴增,對PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定和聚類分析。
　　最后,將所獲柔嫩艾美耳球蟲安徽肥西(AHFX)株按照5×104個卵囊/只的劑量接種80只21d齡雛雞,分別在感染后0d、5d、9d和13d心臟采血,測定平均體重、免疫器官指

5、數(shù)和血清生化等指標。
　　結果表明:(1)通過單卵囊分離技術感染雛雞,在20只雛雞中,有5只感染成功,其成功率達25%。(2)對單卵囊分離所獲球蟲進行增殖,其第二代卵囊大小為(17.0~23.6)μm×(15.8~20.3)μm,平均大小為21.1μm×18.0μm,卵形指數(shù)為1.17,潛在期為140h。將單卵囊所得球蟲(第一代)與增殖后球蟲(第二代)的球蟲卵囊大小進行差異顯著性檢驗(F檢驗),結果顯示差異不顯著(P>0.05),

6、表明第二代球蟲與第一代球蟲卵囊大小相同,且各項其他形態(tài)學特征均符合柔嫩艾美耳球蟲的特征。因此初步鑒定本次所獲球蟲為柔嫩艾美耳球蟲,暫命名為柔嫩艾美耳球蟲安徽肥西(AHFX)株。(3)應用PCR方法,對所獲球蟲卵囊進行分子生物學鑒定,成功擴增出463bp的特異性片段;通過序列分析發(fā)現(xiàn)所擴增的基因與已報道的柔嫩艾美耳球蟲(GQ856310)同一基因片段的同源性高達98.2%,并將測得序列上傳至GenBank,序列登錄號為JX477100。(

7、4)用所獲球蟲卵囊進行雛雞接種試驗顯示:與對照組相比,感染后第5d平均體重、血清Na、TP和ALB含量極顯著降低(P<0.01),血清Ca、GOT、LDH-L和IgA的含量或活性極顯著升高(P<0.01),血清K、GPT和NO含量或活性顯著升高(P<0.05),血清CAT活性顯著降低(P<0.05);第9d時,平均體重和血清ALB含量極顯著降低(P<0.01),血清IgG含量極顯著升高(P<0.01),血清GSH-Px、T-SOD和TP

8、活性或含量顯著降低(P<0.05);第13d時,平均體重和血清T-SOD活性極顯著降低(P<0.01),胸腺指數(shù)、血清CAT、TP的活性或含量顯著降低(P<0.05),血清Ca含量顯著升高(P<0.05);整個試驗過程中,脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、血清P、Mg、ALP和IgM的含量或活性均未表現(xiàn)出明顯變化(P>0.05)。
　　綜上所述,本研究應用單卵囊分離技術成功分離到一株艾美耳球蟲,并通過形態(tài)學和分子生物學方法對其進行了鑒定,確定