Stx2e毒素酶活性位點(diǎn)突變體毒素生物學(xué)性及免疫保護(hù)性的研究.pdf

1、豬水腫病(Edema disease of swine，ED)是仔豬的一種急性致死性傳染病，主要由某些定殖于小腸的特定血清型、產(chǎn)類(lèi)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)引起，又稱(chēng)為腸毒血癥。臨床上該病主要特征是胃大彎、腸系膜和腦部水腫，同時(shí)還常伴有共濟(jì)失調(diào)、驚厥或麻痹等神經(jīng)癥狀。引起豬水腫病的致病因素復(fù)雜，主要的毒力因子是F18菌毛和志賀毒素Ⅱ型變異體e亞型（Stx2e

2、）。
　　大腸桿菌pET-ABmu是由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的可以同時(shí)表達(dá)Stx2eA亞單位（突變體）和Srx2eB亞單位的重組菌，在37℃、 IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)表達(dá)最大量的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB，重組蛋白主要存在于沉淀中，蛋白分子量分別約為35kDa和7.5 kDa。重組蛋白已經(jīng)過(guò)Westem-blot證實(shí)抗原性良好。重組蛋白經(jīng)過(guò)透析純化后，經(jīng)頸部肌肉注射免疫仔豬，免疫后第7d即可產(chǎn)生抗體，在第4

3、2 d抗體達(dá)到最高，豬血清抗體效價(jià)可達(dá)到1∶5120。在Vero細(xì)胞水平上利用免疫豬血清做了對(duì)Stx2e粗提物的的中和試驗(yàn)，結(jié)果表明免疫豬血清對(duì)Stx2e粗提物反應(yīng)后的中和滴度為26，說(shuō)明免疫豬血清對(duì)Stx2e有較強(qiáng)的抑制作用。
　　用純化的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作為免疫原，腹腔注射免疫ICR小鼠，以驗(yàn)證重組蛋白對(duì)于小鼠的毒性和免疫原性，免疫結(jié)束后用致死劑量的Stx2e粗提毒素進(jìn)行攻毒，觀察重組蛋白對(duì)于小鼠

4、的免疫保護(hù)性效果。結(jié)果表明，腹腔注射重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB的小鼠無(wú)任何癥狀，表明重組蛋白對(duì)小鼠無(wú)毒性作用，用最小致死量(MLD)的Stx2e粗提物的攻毒試驗(yàn)表明，腹腔注射重組蛋白能夠刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體，且對(duì)小鼠的平均免疫保護(hù)率能夠達(dá)到93％以上，且小鼠在2個(gè)MLD劑量攻毒時(shí)的平均免疫保護(hù)率能夠達(dá)到90％，表明重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB免疫小鼠能夠產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果。
　

5、　用純化的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作為免疫原，經(jīng)頸部肌肉注射免疫三批次的35日齡的仔豬，以驗(yàn)證重組蛋白對(duì)于仔豬的免疫保護(hù)效果，免疫結(jié)束后用致死劑量的Stx2e粗提毒素進(jìn)行攻毒，觀察重組蛋白對(duì)于仔豬的免疫保護(hù)性效果。結(jié)果表明，頸部肌肉注射重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB免疫仔豬后，仔豬未出現(xiàn)異常癥狀，表明重組蛋白對(duì)仔豬無(wú)影響;在用致死量的Stx2e粗提物的攻毒試驗(yàn)中，試驗(yàn)組攻毒后有1頭發(fā)病，其余未發(fā)病，