桔小實蠅鈉離子通道基因和P450基因RNAi載體構(gòu)建及對柑橘的轉(zhuǎn)化.pdf

1、桔小實蠅Bactrocera dorsalis又名東方果實蠅，廣泛分布于中國各大柑橘產(chǎn)區(qū)，使中國的柑橘產(chǎn)業(yè)面臨著嚴重威脅，每年都對柑橘為害造成巨大經(jīng)濟損失。除此之外，還可危害柑橘、芒果和楊桃等250多種水果蔬菜和作物。目前化學防治仍是控制桔小實蠅的重要措施，然而化學農(nóng)藥施用的不當，不僅影響果品安全，同時還會導致嚴重的抗性藥。因此，化學防治很難實現(xiàn)桔小實蠅的可持續(xù)控制。鈉離子通道(sodium channel，SC)基因是擬除蟲菊酯類和D

2、DT殺蟲劑對昆蟲的主要毒害作用靶標;細胞色素P450單加氧化酶系(cytochrome p450 monoxygenases，P450s)是一類在結(jié)構(gòu)性質(zhì)上類似的一族蛋白質(zhì)，有報道表明，其與昆蟲對擬除蟲菊酯類和有機氯類殺蟲劑的抗性有關。應用RNAi技術(shù)可達到昆蟲鈉離子通道基因和P450基因不能正常表達，從而增強昆蟲對農(nóng)藥的敏感性、影響其發(fā)育及繁殖，因此可以通過農(nóng)桿菌介導植物遺傳轉(zhuǎn)化和RNAi技術(shù)獲得抗桔小實蠅材料。本試驗將鈉離子通道JN

3、416983基因以及P450 CYP6EK1基因的特異序列作為靶標序列，構(gòu)建這兩個基因的RNA干擾載體，采用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化柑橘，旨在獲得對桔小實蠅有抗性的新材料。
　　1、RNAi干擾載體的構(gòu)建
　　NCBI上搜索桔小實蠅鈉離子通道基因和細胞色素P450基因全長序列，Blast比對其保守序列，設計特異性的兩端加相應酶切位點的引物，構(gòu)建dsRNA載體。
　　A.載體PFGC5941-C1R1/C2R2的構(gòu)建:
　　

4、鈉離子通道基因正向目的片段與反向目的片段上游下游添加的限制性內(nèi)切酶分別為XhoⅠ和NcoⅠ、XbaⅠ和BamHⅠ識別序列，克隆得到相應的正向和反向相重復的基因片段。將正向目標基因C1R1質(zhì)粒進行酶切，同時將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同的兩個酶酶切，用T4連接酶將其連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，隨機挑選幾個單克隆菌落，用通用引物C1R1，PCR檢測篩選正確的單菌落，提取質(zhì)粒，然后酶切驗證得到“PFGC5941-正向片段C1

5、R1”;將得到的“PFGC5941-C1R1”質(zhì)粒進行酶切，同時用相同酶對反向目標基因C2R2進行酶切，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，隨機挑選單克隆菌落，酶切驗證，得到載體“PFGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2”。
　　B.載體PFGC5941-P1F1/P2F2的構(gòu)建:
　　構(gòu)建方法同上，在細胞色素P450基因正向目的片段兩端分別加上限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NcoⅠ識別序列;在反向目的片段兩端分別加

6、上XbaⅠ和BamHⅠ識別序列，通過雙酶切，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，提取質(zhì)粒，分別進行酶切及PCR擴增驗證，最終獲得載體“PFGC5941-正向片段P1F1/反向片段P2F2”。
　　2、由農(nóng)桿菌介導柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的驗證
　　將上述獲得的兩個質(zhì)粒電擊法分別轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105菌株。PCR驗證后，用含有質(zhì)粒“PFGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2”的農(nóng)桿菌侵染錦橙上胚軸，用除草劑