甘藍(lán)柱頭SI關(guān)鍵元件編碼基因的克隆、定位與蛋白質(zhì)互作研究.pdf

1、包括甘藍(lán)在內(nèi)的蕓薹屬植物是孢子體自交不親和性的典型代表，其自交不親和反應(yīng)起始于S基因座的兩個(gè)基因SCR(S locus cysteine-rich protein)與SRK(S locusprotein kinase)的編譯產(chǎn)物的相互識(shí)別，同配型花粉的信號(hào)由柱頭乳突細(xì)胞外被傳至胞內(nèi)，由SRK的激酶域激活A(yù)RC1(ARM repeat containing)，進(jìn)一步將信號(hào)傳至EXO70A1，再歷經(jīng)后續(xù)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致自交不親和。本文以

2、三種自交不親和相關(guān)元件(SRK、ARC1和EXO70A1)及編碼基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)三種基因的序列、染色體定位及其編碼蛋白的互作特性進(jìn)行了研究。簡(jiǎn)要闡述如下：
　　 1.運(yùn)用PCR技術(shù)從甘藍(lán)、大白菜與甘藍(lán)型油菜中分離出EXO70A1基因，并對(duì)所克隆的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過(guò)轉(zhuǎn)化酵母Y187和半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BoEXO70A1基因的表達(dá)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 ①三種蕓薹屬植物EXO70A1的編碼框均(codin

3、g sequences，CDS)為1917bp，且呈現(xiàn)出97.1％的序列一致性；它們的gDNA序列均為單一序列，長(zhǎng)度分別為3797bp、3752bp和3770bp，其序列一致度高達(dá)91.0％，且均由12個(gè)外顯子及11個(gè)內(nèi)含子組成，除了第4、5、6、8個(gè)內(nèi)含子外，其余內(nèi)含子的保守性均低于外顯子；推導(dǎo)的三種蛋白質(zhì)序列(BnEXO70A1、BrEXO70A1和BoEXO70A1)的相似度與序列一致性分別高達(dá)99.8％與98.1％，其二級(jí)結(jié)構(gòu)、

4、三維結(jié)構(gòu)及理化特性也高度相似。
　　 ②所克隆的EXO70A1基因的11個(gè)內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符合“GU-AG”法則，剪切受體(AG)的前20-50個(gè)堿基的位置存在一段保守的序列“CU(A/G)A(C/U)”。
　　 ③三種蕓薹屬植物與擬南芥EXO70A1基因的12個(gè)外顯子的對(duì)應(yīng)序列長(zhǎng)度完全相同，所構(gòu)成的編碼區(qū)的序列一致性高達(dá)90.1％，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列之間的相似度與一致性分別高達(dá)99.8％與93.7％。
　　 ④

5、分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)不同植物間的EXO70A1在整個(gè)EXO70蛋白家族中表現(xiàn)出較高的保守性。
　　 ⑤BoEXO70A1在酵母細(xì)胞Y187呈現(xiàn)弱表達(dá)；EXO70A1在甘藍(lán)的雄蕊、幼莖、幼嫩花瓣、雌蕊、幼根及葉片中均能表達(dá)，可能屬于組成型表達(dá)基因，但是其表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期的不同器官中呈現(xiàn)出差異，授粉前雌蕊中最高，雄蕊中最低。
　　 2.運(yùn)用PCR技術(shù)從甘藍(lán)、大白菜與甘藍(lán)型油菜中同源克隆出ARC1基因的DNA，并對(duì)所克隆的序列

6、進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 ①ARC1基因在3種植物中均不包含內(nèi)含子序列，BoARC1蛋白編碼序列由1992bp(包含終止密碼子)構(gòu)成，而B(niǎo)rARC1和BnARC1的蛋白編碼序列由1986bp構(gòu)成，即后者在序列上比甘藍(lán)ARC1少編碼2個(gè)氨基酸序列。
　　 ②比對(duì)發(fā)現(xiàn)3種ABC1編碼序列存在93.8％的一致性，在144處的核苷酸存在差異，其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)之間存在99.4％的序列相似性和92.2％序列一致性，即僅有51處的氨基

7、酸存在差異；兩兩序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)BnARC1與BrARC1基因在序列上的更為接近。
　　 ③推導(dǎo)的3種ARCl蛋白都包含相同的結(jié)構(gòu)域，其共有的組成為：UND(N-terminal domain)、中間的U-box(U-box domain)和C端的ARM(armadillorepeat)，并且3種ARC1蛋白在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)上都極為相似。
　　 3.運(yùn)用PCR技術(shù)從甘藍(lán)克隆出BoSRK基因的CDS，并對(duì)所克隆的序列連同下

8、載的31條SRK序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析：
　　 ①SRK基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，編碼816-860個(gè)氨基酸，第一個(gè)外顯子編碼SRK的信號(hào)肽和胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸。
　　 ②盡管不同類型SRK的編碼區(qū)核甘酸序列與對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列均有較高的相似度，但胞外結(jié)構(gòu)域之間存在著的3個(gè)高變區(qū)造成了SRK蛋白呈現(xiàn)多態(tài)性，高變區(qū)氨基酸可能與同單元型的SCR/SP11相互識(shí)別發(fā)揮重要作用。
　　 ③SRK的胞外域與S基因座另

9、一個(gè)基因的編碼產(chǎn)物SLG有著極為相似的序列和結(jié)構(gòu)，可能是源于進(jìn)化過(guò)程中S域的基因倍增。
　　 4.以甘藍(lán)幼根為材料，制備小量游離的細(xì)胞核，然后通過(guò)移動(dòng)界面法制備出染色質(zhì)纖維，接著以重復(fù)基因序列5S rRNA為探針驗(yàn)證染色質(zhì)纖維的制備效果：
　　 ①?gòu)挠啄鄹@取的游離細(xì)胞核能夠有效的避免葉綠體色素的干擾，用來(lái)制備的染色質(zhì)纖維有利于后面的原位雜交信號(hào)的檢測(cè)。
　　 ②中期染色體致密程度較高，以2-4kb的單拷貝或低拷

10、貝核酸序列為探針，在中期染色體雜交信號(hào)檢出率較低，僅能達(dá)到5％；將雜交前的染色體用胃蛋白酶酶解的時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，可以使染色體變的更加松散，能夠適當(dāng)提高雜交信號(hào)檢出率；以有絲分裂前中期染色體和粗線期染色體為載體，雜交信號(hào)的檢出率可以有較大的提高；以染色質(zhì)纖維為載體，雜交信號(hào)檢出率可以達(dá)到較為理想的狀態(tài)。
　　 5.以SRK基因在中期染色體和粗線期染色體上的雜交，綠色的雜交信號(hào)僅存在于一對(duì)同源染色體上，暗示SRK在甘藍(lán)的染色體上可能只

11、有一個(gè)拷貝，但難以確定SRK基因在染色體上的具體位置；搜索甘藍(lán)和白菜的染色體和基因數(shù)據(jù)庫(kù)得知：SRK基因位于甘藍(lán)7號(hào)染色體上8732037-8675105 bp的核酸區(qū)段，對(duì)應(yīng)白菜的7號(hào)染色體(17204000-17300000bp)的染色體區(qū)段。
　　 6.ARC1基因在甘藍(lán)和白菜基因組中僅有一個(gè)拷貝，位于甘藍(lán)4號(hào)染色體的正鏈的(35662808-35664799bp)核酸區(qū)段，對(duì)應(yīng)于Brassica rapa的4號(hào)染色體(1

12、5107313-15109298bp)區(qū)段的正鏈。
　　 7.EXO70A1基因在中期染色體及粗線期染色體定位的結(jié)果并不一致。以EXO70A1基因的DNA序列為探針，搜索甘藍(lán)和白菜的染色體和基因數(shù)據(jù)庫(kù)得知：EXO70A1基因在甘藍(lán)基因組中僅有一個(gè)拷貝，位于甘藍(lán)9號(hào)染色體(39669464-39673197bp)區(qū)段的負(fù)鏈，與中期染色體原位雜交結(jié)果不同的原因可能是由于甘藍(lán)基因組中存與EXO70A1基因序列相近的同源基因造成；對(duì)應(yīng)于

13、Brassica rapa的10號(hào)染色體(17076191-17079967)區(qū)段的負(fù)鏈。
　　 8.S位點(diǎn)受體激酶(SRK)和臂重復(fù)蛋白(ARC1)是蕓薹屬植物自交不親和反應(yīng)的2種重要的信號(hào)元件，SRK-ARC1的互作可能決定著自交不親和反應(yīng)下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)構(gòu)建的重組表達(dá)載體在酵母細(xì)胞中無(wú)毒性和自激活作用產(chǎn)生。本研究從結(jié)球甘藍(lán)與羽衣甘藍(lán)柱頭中克隆出的SRKJ、ARC1與EXO70A1基因的全長(zhǎng)和局部編碼區(qū)，分別連接至載體pG

14、ADT7和PGBKT7，然后應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)和分析這些蛋白質(zhì)兩兩之間的相互作用。
　　 羽衣甘藍(lán)ARC1存在5個(gè)連續(xù)的臂重復(fù)區(qū)，與結(jié)球甘藍(lán)ARC1的氨基酸序列一致性達(dá)到98％；3個(gè)實(shí)驗(yàn)組Y2HGold[pGBKT7-ARC1]×Y187[pGADT7-SRKJ]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1T3]× Y187[pGADT7-SRKJ]和Y2HGold[pGBKT7-ARC1T4]×Y187[pGADT7-SRKJ

15、]能夠在缺陷型培養(yǎng)基QDA/X/AbA上生長(zhǎng)，證明三組融合酵母都激活了報(bào)告基因的表達(dá)；2個(gè)實(shí)驗(yàn)組Y2HGold[pGBKT7-ARC1T1]×Y187[pGADT7-SRKJ]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1T2]×Y187[pGADT7-SRKJ]不能在四缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的報(bào)告基因并未激活，說(shuō)明ARC1T1-SRKJ和ARC1T2-SRKJ均未發(fā)生互作。表明互作的區(qū)域位于連續(xù)的臂重復(fù)區(qū)，兩種甘藍(lán)ARC1的氨基酸差

16、異不足以引起互作區(qū)所需的正確構(gòu)象的改變。
　　 9.EXO70A1可能是ARC1下游的另一種信號(hào)元件，它和ARC1的互作可能對(duì)SI反應(yīng)產(chǎn)生重要的作用。本研究從甘藍(lán)型油菜與羽衣甘藍(lán)柱頭中克隆出ARC與EXO70A1基因的全長(zhǎng)和局部編碼區(qū)，分別連接至載體pGADT7和PGBKT7，然后應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)和分析這些蛋白質(zhì)兩兩之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ARC1蛋白在羽衣甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜中存在45個(gè)氨基酸的差異，其序列相似度與一致性分

17、別達(dá)到95.9％和93.9％；推導(dǎo)的EXO70A1在羽衣甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中僅有6個(gè)氨基酸的差異，其序列相似度與一致性分別達(dá)到99.4％和98.9％；EXO70A1蛋白在種內(nèi)和物種間都保持著高度的保守性，其保守的程度高于ARC1。在二倍體酵母細(xì)胞中，全長(zhǎng)的ARC1與EXO70A1之間存在較強(qiáng)的相互作用，能激活4個(gè)報(bào)告基因(ADE2、HIS3、AUR1-C和MEL1)的表達(dá)；去除C-端(包括臂重復(fù)區(qū))316個(gè)氨基酸殘基后的ARC1N與EXO

18、70A1之間表現(xiàn)出較弱的相互作用，只能激活3個(gè)報(bào)告基因(ADE2、AUR1-C和MEL1)的表達(dá)，表明ARC1的臂重復(fù)區(qū)可能并不位于ARC1與EXO70A1的互作界面的核心區(qū)段，ARC1的N-端結(jié)構(gòu)域?qū)RC1-EXO70A1互作起關(guān)鍵作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同ARC1-EXO70A1組合的互作強(qiáng)度相當(dāng)，其可能原因是ARC1和EXO70A1在甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜中存在的這些序列差異并未影響ARC1-EXO70A1互作界面的構(gòu)象。
　　 由此

19、可以得出如下結(jié)論：
　　 1.ARC1和EXO70A1在蕓薹屬植物中整體高度保守；EXO70A1在酵母轉(zhuǎn)化株和甘藍(lán)各器官中的組成型表達(dá)有所差異，暗示該蛋白可能在植物細(xì)胞中具有多種重要的功能。SRK基因的保守性低于ARC1和EXO70A1，其編碼產(chǎn)物SRK的多態(tài)性源于S域的3個(gè)高變區(qū)，同時(shí)也是造成蕓薹屬植物自交不親和不斷進(jìn)化的主因。
　　 2.利用幼嫩根為材料能夠制備較好效果的無(wú)壁細(xì)胞核。熒光原位雜交技術(shù)和運(yùn)用BLAST搜

20、索基因組用于DNA序列的染色體定位得到相同或相近的結(jié)果，但是針對(duì)基因組中出現(xiàn)與目的序列相似度較高的DNA序列時(shí)，在染色體上原位雜交的結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)一定的誤差，表明原位雜交存在一定的局限性。
　　 3.SRKJ和ARC1發(fā)生相互作用，和SRKJ發(fā)生互作的區(qū)域位于ARC1的C端結(jié)構(gòu)域。ARC1能夠與EXO70A1發(fā)生較強(qiáng)的互作，其與EXO70A1發(fā)生互作的區(qū)域位于ARC1的N端包括U-box的構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。這同時(shí)表明ARC1蛋白是一種