鐵線蕨總DNA提取及其轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、以鐵線蕨為研究材料，首先對(duì)其總DNA提取方法進(jìn)行改良，并證明了改良方法的優(yōu)越性；其次分別建立了鐵線蕨孢子體與配子體的再生體系，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍法對(duì)其進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，從而探討此再生體系基礎(chǔ)上進(jìn)行的鐵線蕨轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的可行性。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.蕨類植物因含有高酚、高糖等次生代謝物而使其總DNA的提取難度大于其它植物。以鐵線蕨孢子體世代與配子體世代植株為材料，采用9種不同方法提取總DNA，并通過(guò)檢

2、測(cè)體系對(duì)所得總DNA進(jìn)行分析。結(jié)果表明：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的配子體為材料獲得的鐵線蕨總DNA的純度明顯高于孢子體，但是產(chǎn)量也明顯低于孢子體；對(duì)于配子體而言，CTAB法、SDS法、高鹽低pH法、尿素提取法、試劑盒法都能提取到較為純凈的總DNA，但經(jīng)過(guò)DNA完整性檢測(cè)體系篩選后，改良CTAB法結(jié)果最優(yōu)；對(duì)于含大量次生代謝產(chǎn)物的孢子體植株而言，改良CTAB法得到的總DNAg巨度明顯高于其它，通過(guò)后續(xù)的DNA完整性檢測(cè)得到與配子體相同結(jié)論。
　　

3、 2.鐵線蕨再生體系的建立。以鐵線蕨孢子體植株拳卷葉或初伸展的羽葉為材料，光照條件選擇12h光照/12h黑暗，首先在0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D(或1 mg/L2，4-D)的MS培養(yǎng)基中初步誘導(dǎo)產(chǎn)生緊密型愈傷組織，后將其繼續(xù)在同樣培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，當(dāng)繼代3～4代后轉(zhuǎn)移到0.5mg，L6-BA或1 mg/L6-BA的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚再生，之后轉(zhuǎn)移至不含激素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)再生孢子體小苗，確定鐵線蕨孢子體誘導(dǎo)愈

4、傷組織的再分化體系。以鐵線蕨孢子為材料，其萌發(fā)以紅光誘導(dǎo)2 d為最佳，在實(shí)驗(yàn)室條件下其生長(zhǎng)周期主要?jiǎng)澐譃橐韵?個(gè)時(shí)期：孢子，孢子萌發(fā)，心形原葉體時(shí)期，精子器、頸卵器發(fā)育期，幼小孢子體植株，成熟孢子體植株產(chǎn)生孢子，確定為鐵線蕨配子體再生體系。
　　 3.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍法對(duì)鐵線蕨進(jìn)行轉(zhuǎn)基因初探。研究結(jié)果表明：兩種方法在對(duì)鐵線蕨不同材料進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)后，已長(zhǎng)出精子器和頸卵器的原葉體均表現(xiàn)出較高的敏感性，通過(guò)GFP檢測(cè)得到最多