草原濕地土壤總DNA提取方法及其在氨氧化微生物研究中的應(yīng)用.pdf

1、DNA分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,為全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文新建立了兩種從濕地土壤中提取微生物總DNA的方法,即氯化鈣-SDS-酶法(新方法1)和玻璃珠-氯化鈣-SDS法(新方法2)。在直接提取DNA過(guò)程中采用氯化鈣去除腐殖酸,DNA提取緩沖液中不使用EDTA螯合劑,提取過(guò)程用時(shí)分別為4 h左右和2 h。
　　 氯化鈣-SDS-酶法與中科院土壤DNA提取法以及國(guó)產(chǎn)試劑盒兩種方法相比,可高效去除濕地土壤腐殖酸,純度較

2、高,滿足16S rDNA的PCR擴(kuò)增,為微生物生態(tài)學(xué)研究提供了一種高效的濕地土壤微生物總DNA提取和純化技術(shù)。但方法1應(yīng)用于微生物功能基因的研究受到限制,基于以上因?yàn)?我們對(duì)氯化鈣-SDS-酶法進(jìn)行改進(jìn)。
　　 依據(jù)微生物不均勻地分布在微團(tuán)聚體內(nèi)部以及微團(tuán)聚體外部的孔隙中并通過(guò)不同的結(jié)合機(jī)制緊密地結(jié)合到土壤顆粒上以及氨氧化細(xì)菌(AOB)具有依附性的特點(diǎn),通過(guò)玻璃珠分散土壤顆粒內(nèi)部和表面結(jié)合的細(xì)胞,最終獲得一種適用于氨氧化細(xì)菌(A

3、OB)和氨氧化古菌(AOA)amoA基因片段PCR擴(kuò)增的快速DNA提取方法,即玻璃珠-氯化鈣-SDS法,與氯化鈣-SDS-酶法和UltraCleanTM SoilDNA Isolation Kit試劑盒進(jìn)行比較,對(duì)16S rDNA、AOB和AOA中amoA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明方法2更適合于氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌amoA基因的PCR擴(kuò)增。
　　 對(duì)玻璃珠-氯化鈣-SDS法獲得的基因組DNA擴(kuò)增得到的AOB和AOA中am

4、oA基因片段產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。氨氧化細(xì)菌amoA基因PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為491 bp,親緣關(guān)系分析表明4種土壤樣品的19個(gè)克隆聚為三個(gè)簇,都與Betaproteobacteria Nitrosospira相關(guān),從而說(shuō)明Betaproteobacteria Nitrosospira可能是這些土壤中主要的氨氧化細(xì)菌類群。氨氧化古菌amoA基因PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為647 bp,親緣關(guān)系分析表明四種土壤樣品的20個(gè)克隆