草原濕地土壤總DNA提取方法及其在氨氧化微生物研究中的應用.pdf

1、DNA分子生物學技術的廣泛應用,為全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文新建立了兩種從濕地土壤中提取微生物總DNA的方法,即氯化鈣-SDS-酶法(新方法1)和玻璃珠-氯化鈣-SDS法(新方法2)。在直接提取DNA過程中采用氯化鈣去除腐殖酸,DNA提取緩沖液中不使用EDTA螯合劑,提取過程用時分別為4 h左右和2 h。
　　 氯化鈣-SDS-酶法與中科院土壤DNA提取法以及國產試劑盒兩種方法相比,可高效去除濕地土壤腐殖酸,純度較

2、高,滿足16S rDNA的PCR擴增,為微生物生態(tài)學研究提供了一種高效的濕地土壤微生物總DNA提取和純化技術。但方法1應用于微生物功能基因的研究受到限制,基于以上因為,我們對氯化鈣-SDS-酶法進行改進。
　　 依據微生物不均勻地分布在微團聚體內部以及微團聚體外部的孔隙中并通過不同的結合機制緊密地結合到土壤顆粒上以及氨氧化細菌(AOB)具有依附性的特點,通過玻璃珠分散土壤顆粒內部和表面結合的細胞,最終獲得一種適用于氨氧化細菌(A

3、OB)和氨氧化古菌(AOA)amoA基因片段PCR擴增的快速DNA提取方法,即玻璃珠-氯化鈣-SDS法,與氯化鈣-SDS-酶法和UltraCleanTM SoilDNA Isolation Kit試劑盒進行比較,對16S rDNA、AOB和AOA中amoA基因片段進行PCR擴增。結果表明方法2更適合于氨氧化細菌和氨氧化古菌amoA基因的PCR擴增。
　　 對玻璃珠-氯化鈣-SDS法獲得的基因組DNA擴增得到的AOB和AOA中am

4、oA基因片段產物進行克隆測序,并構建系統進化樹進行系統發(fā)育分析。氨氧化細菌amoA基因PCR擴增長度為491 bp,親緣關系分析表明4種土壤樣品的19個克隆聚為三個簇,都與Betaproteobacteria Nitrosospira相關,從而說明Betaproteobacteria Nitrosospira可能是這些土壤中主要的氨氧化細菌類群。氨氧化古菌amoA基因PCR擴增長度為647 bp,親緣關系分析表明四種土壤樣品的20個克隆