農(nóng)業(yè)廢物堆肥中微生物總DNA提取方法的研究及其應(yīng)用.pdf

1、堆肥是利用自然界中廣泛存在的微生物，在人工控制的條件下，將可生物降解的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為肥料的過(guò)程。然而，可培養(yǎng)微生物僅占自然界微生物的0.1％～10％，不能很好地反映自然環(huán)境中微生物多樣性的原始狀態(tài)。隨著分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法的發(fā)展，基于16S rDNA基因的分子生物學(xué)方法逐漸被用來(lái)分析復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。本文對(duì)農(nóng)業(yè)廢物垃圾進(jìn)行堆肥處理，并采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—變性梯度凝膠電泳(Polymerase Chain Reaction—Denat

2、ure Gradient GelElectrophoresis，PCR—DGGE)技術(shù)對(duì)堆肥過(guò)程中微生物群落與木質(zhì)纖維素降解的關(guān)系進(jìn)行了研究。 首先在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件下，研究了用于其微生物群落多樣性及演替情況分析的微生物基因組提取方法。對(duì)比3種(溶壁酶法，超聲波法，液氮研磨+CTAB法)可同時(shí)從固態(tài)發(fā)酵中提取細(xì)菌和真菌DNA的方法。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA產(chǎn)量與純度；使用細(xì)菌16s rDNA基因通用引物(341F和907R)

3、和真菌18S rDNA基因通用引物(NU—SSU—0817和NU—SSU—119)對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)法對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行多樣性分析。結(jié)果顯示，三種方法得到的粗提和純化DNA長(zhǎng)度都約為23kb；細(xì)菌和真菌PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別約為586bp和422bp；DGGE分析表明3種方法提取的DNA反映的微生物多樣性比較一致；但通過(guò)紫外分光光度計(jì)的測(cè)定表明：溶壁酶法提取固態(tài)發(fā)酵中微生物總DNA產(chǎn)量最高，超聲波

4、法次之，液氮研磨+CTAB法最差。所以綜合以上各結(jié)果，溶壁酶法最優(yōu)。 采用篩選到的最佳提取DNA方法，從農(nóng)業(yè)廢物垃圾好氧堆肥樣品中提取出堆肥混合菌群的總DNA，粗提DNA經(jīng)過(guò)純化后，采用GC—341F/907R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增16SrDNA基因段，用DGGE進(jìn)行分離和鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而得出農(nóng)業(yè)廢物垃圾堆肥過(guò)程中微生物種群多樣性的信息。DGGE圖譜顯示，堆肥初期有較多的微生物多樣性，隨著堆肥溫度的升高，一些中溫期的微生物被

5、淘汰，高溫期微生物多樣性減少，同時(shí)噬熱菌出現(xiàn)，并成為優(yōu)勢(shì)菌群。高溫期過(guò)后，微生物多樣性進(jìn)一步銳減。從而表明堆肥的溫度是影響堆體中微生物生長(zhǎng)的重要因素，不同的溫度，堆體具有適應(yīng)這個(gè)溫度的不同的優(yōu)勢(shì)菌種。同時(shí)，對(duì)幾種特征堆肥參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)39d的堆肥，堆肥產(chǎn)物基本達(dá)到要求。而通過(guò)對(duì)木質(zhì)纖維素降解以及各酶活(Lac、LiP、MnP)的測(cè)定，可以發(fā)現(xiàn)在微生物種群數(shù)增加階段，纖維素、半纖維素降解速度和酶活量都有增加。而在微生物數(shù)遞