基于核酸探針和金納米顆粒的小分子和酶活性電化學(xué)檢測(cè).pdf

1、生物傳感器的研究已經(jīng)成為分析化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)非常重要的研究方向,并在醫(yī)療、醫(yī)藥、生物工程、環(huán)境保護(hù)、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。其中,電化學(xué)生物傳感器是基于生物識(shí)別的高度專(zhuān)一性和電化學(xué)信號(hào)發(fā)展起來(lái)的一種分析技術(shù),具有靈敏度高、選擇性好、成本低、易于微型化等優(yōu)點(diǎn),人們對(duì)此作出了深入和廣泛的研究。納米材料由于具有尺寸小、比表面積大、生物相容性好等一些特殊的性質(zhì)而受到人們的廣泛關(guān)注。大量研究表明,將納米材料應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器中,

2、可以大大提高生物傳感器的響應(yīng)性能,為生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物分析等領(lǐng)域提供新的研究途徑。本論文瞄準(zhǔn)這一研究熱點(diǎn),將生物化學(xué)、納米技術(shù)和電分析化學(xué)理論和方法有機(jī)地結(jié)合起來(lái),構(gòu)建了基于生物識(shí)別的高度專(zhuān)一性和靈敏性的電化學(xué)生物傳感器,并將其應(yīng)用于對(duì)生物小分子和酶活性的檢測(cè),主要包括以下三方面的研究工作:
　　 一、基于發(fā)夾型DNA和E.coli DNA連接酶的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸電化學(xué)檢測(cè)利用發(fā)夾型DNA探針和E.coli DNA連接

3、酶發(fā)展了一種高靈敏、高特異NAD+電化學(xué)檢測(cè)新方法。在該方法中,發(fā)夾型DNA的3'端修飾巰基,5'端修飾生物素,以莖環(huán)狀自組裝修飾到金電極上,當(dāng)檢測(cè)體系中無(wú)NAD+時(shí),生物素靠近電極表面,阻礙電子傳遞,處于“eT OFF”狀態(tài);當(dāng)檢測(cè)體系中有NAD+存在時(shí),E.coli DNA連接酶被激活,兩段與發(fā)夾型DNA環(huán)部互補(bǔ)的DNA片段發(fā)生連接反應(yīng)將發(fā)夾型DNA打開(kāi),生物素遠(yuǎn)離電極表面,發(fā)生電子的自由傳遞,產(chǎn)生可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)(eT ON)。

4、采用該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)NAD+的特異性檢測(cè),其線性范圍為3 Nm-5μm,檢測(cè)下限為1.8 Nm。
　　 二、基于金納米顆粒的電化學(xué)傳感器檢測(cè)端粒酶的研究利用端粒酶可以以自身為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)和金納米顆粒較大的比表面積能夠承載較多核酸片段的特點(diǎn),構(gòu)建了一種檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的電化學(xué)方法。將末端含有端粒酶引物片段的模板DNA鏈修飾在金納米顆粒修飾的電極上,末端標(biāo)記亞甲基藍(lán)(MB)的信號(hào)探針與電極上的模板DNA互補(bǔ)配對(duì),MB能

5、夠與電極表面發(fā)生電子傳遞,產(chǎn)生可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)。在加入端粒酶和dNTPs后,端粒酶引物片段不斷延伸,延伸后的DNA片段可以與模板DNA互補(bǔ)配對(duì),將已經(jīng)連接了的檢測(cè)鏈競(jìng)爭(zhēng)下來(lái),游離出的信號(hào)探針末端電活性物質(zhì)MB遠(yuǎn)離電極表面,阻礙了與電極表面的電子傳遞,電化學(xué)信號(hào)變小,這是一個(gè)信號(hào)從無(wú)到有再到無(wú)的過(guò)程,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶的檢測(cè)。該方法可以檢測(cè)出2×102個(gè)/mLHela細(xì)胞內(nèi)的端粒酶。
　　 三、基于金納米顆粒的放大作用對(duì)DNA聚合

6、酶KF-的電化學(xué)檢測(cè)利用金納米顆粒具有較小尺寸、容易被帶到電極表面以及較大的比表面積能夠承載較多核酸片段的特點(diǎn),發(fā)展了一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)DNA聚合酶KlenowFragment(exo-)(KF-)的電化學(xué)方法。在該方法中,首先將巰基修飾的引物片段修飾在電極上,加入模板DNA以及標(biāo)記DNA的金納米顆粒后,由于引物片段和標(biāo)記在金納米顆粒上DNA都能與模板鏈進(jìn)行雜交,從而使得模板鏈同時(shí)連接了引物片段和金納米顆粒標(biāo)記的DNA(AuNPs-DN

7、A)片段,再加入電活性物質(zhì)RuHex,RuHex能通過(guò)靜電吸附作用結(jié)合在電極表面的DNA上,由于AuNPs帶來(lái)的DNA在電極表面堆積,從而能夠吸附大量的RuHex,使得RuHex與電極表面電子傳遞增強(qiáng),產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)加入dNTPs以及DNA聚合酶時(shí),引物片段發(fā)生延伸反應(yīng),延伸的DNA鏈能夠?qū)?biāo)記了DNA的AuNPs競(jìng)爭(zhēng)下來(lái),AuNPs被游離出來(lái)并帶走大量的RuHex,信號(hào)減小,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合酶的檢測(cè)。該方法可以檢測(cè)到5 U/Ml的K