利用mRNA差異顯示技術克隆球孢白僵菌在蟬蛻和蠶血淋巴誘導下的特異表達基因.pdf

1、隨著人們對環(huán)境保護認識的加深，由化學農藥產生的3R問題已經越來越受到重視。利用生物殺蟲劑控制害蟲已經是不可逆轉的趨勢。蟲生真菌作為農林生態(tài)系中昆蟲的重要致死因子，由于其對環(huán)境相容，不易產生抗藥性，以及資源豐富，開發(fā)成本較低等優(yōu)點，已經被作為控制害蟲爆發(fā)的重要因子。但是，其應用仍然存在諸多缺點，如藥效慢，環(huán)境適應性差等。因此，如何提高球孢白僵菌的毒力與抗逆性始終是業(yè)內研究的熱點。
　　 要改造和構建高毒、速效、穩(wěn)定的新型白僵菌菌株

2、，必須了解白僵菌侵染昆蟲的機制與機理。本研究以球孢白僵菌為研究對象，通過模擬球孢白僵菌侵染昆蟲的過程，分析在侵染過程中球孢白僵菌的分子對策，試圖發(fā)現(xiàn)了一些與侵染過程相關的基因。
　　 首先，本研究對白僵菌進行液體培養(yǎng)，并加入蟬蛻和蠶血淋巴進行誘導培養(yǎng)24h，分別提取誘導菌絲的總RNA，反轉錄為cDNA，加入差異顯示引物進行PCR擴增；PAGE膠電泳后，將膠上的差異條帶割膠回收，克隆測序。通過Blast序列比對，結果發(fā)現(xiàn)：9個與昆

3、蟲侵染機制相關的基因序列，27個假定蛋白基因序列，5個未知序列；其中與侵染過程相關的表達基因，包括：蛋白酶成熟因子、尿囊通透酶、膜上G蛋白、以及第二信使cAMP等編碼基因。這些基因在血淋巴和蟬蛻誘導與對照處理下，均存在差異表達。
　　 其次，本研究進一步利用real-time PCR技術對蛋白酶成熟因子的表達進行了精確驗證；結果發(fā)現(xiàn)：在蟬蛻誘導條件下，與對照處理相比，該基因的表達量為上調了8倍左右。
　　 本研究通過mR