豬IRF1抗病毒功能的初步研究及穩(wěn)定表達(dá)豬IRF1基因PK-15細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、干擾素調(diào)節(jié)因子(IFN regulatory factors，IRFs)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生以及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。其中，IRF3和IRF7在干擾素的表達(dá)調(diào)控中起重要作用，參與機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)除IRF3和IRF7之外，IRF1在抗病毒免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。IRF1可能是IRF3和IRF7之外的另一種調(diào)節(jié)抗病毒免疫的轉(zhuǎn)錄因子，而且當(dāng)IRF3/7或IFNs的功能被抑制時(shí)，I

2、RF1可能為調(diào)節(jié)干擾素(IFNs)和干擾素激活基因(ISGs)的表達(dá)提供了備選機(jī)制。對(duì)于控制那些能夠拮抗IRF3和IRF7以及IFNs表達(dá)的病毒而言，IRF1介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答可能發(fā)揮著極其重要的作用。目前，豬IRF1的研究相對(duì)較少，其具有怎樣的功能特點(diǎn)，特別是在豬抗病毒先天免疫過(guò)程中的作用如何尚不清楚。因此，本文開展了以下研究，以期更多了解豬IRF1在機(jī)體先天性抗病毒免疫機(jī)制中的作用。
　　1.豬IRF1基因的體內(nèi)表達(dá)分析及病毒感

3、染對(duì)其表達(dá)的影響向
　　為研究豬IRF1基因的組織分布，采集健康成年豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腦等組織，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)各組織中IRF1基因的表達(dá)量。結(jié)果表明IRF1在所有檢測(cè)組織中均有表達(dá)，其中脾臟中表達(dá)量最高，其次是淋巴結(jié)和肝臟，而在心臟、腦和膀胱等其他組織中表達(dá)量較低。IRF1在脾臟和淋巴結(jié)等免疫相關(guān)組織中表達(dá)量較高，提示其可能參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。為進(jìn)一步研究病毒感染狀態(tài)下IRF1基因表達(dá)的變化，分別選取兩

4、種DNA病毒（豬偽狂犬病毒，PRV;豬細(xì)小病毒，PPV）和兩種RNA病毒(豬傳染性胃腸炎病毒，TGEV;豬水泡性口炎病毒，VSV)為代表，分別檢測(cè)了PK-15細(xì)胞在不同病毒感染后IRF1的表達(dá)情況。結(jié)果表明除PRV流行毒株（QXX株）外，其他參試病毒感染均可上調(diào)IRF1基因的表達(dá)，表明豬IRF1參與了機(jī)體對(duì)病毒感染的應(yīng)答反應(yīng)。
　　2.豬IRF1對(duì)干擾素表達(dá)和病毒復(fù)制的影響
　　為研究豬IRF1對(duì)干擾素表達(dá)的影響，從豬外周血

5、淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增豬IRF1基因，定向克隆到PCAGGS-HA載體中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-HA-pIRF1，轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，過(guò)表達(dá)豬IRF1基因。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)無(wú)刺激狀態(tài)和poly(I∶C)刺激下豬IFN-β的啟動(dòng)子活性，并通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)豬IRF1在無(wú)刺激的狀態(tài)下即可激活豬IFN-β的啟動(dòng)子，并上調(diào)IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平。在poly(I∶C)誘導(dǎo)下，過(guò)表達(dá)IRF1能夠更為顯

6、著的激活I(lǐng)FN-β的啟動(dòng)子，而且這種激活能力比豬IRF3和豬IRF7的激活能力更強(qiáng)。然而，當(dāng)通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲減PK-15細(xì)胞中IRF1的表達(dá)后，在poly(I∶C)誘導(dǎo)下，IFN-β的表達(dá)水平并無(wú)顯著變化，說(shuō)明豬IRF1能促進(jìn)干擾素的表達(dá)，但不是誘導(dǎo)干擾素表達(dá)的必要因子。
　　為探索豬IRF1對(duì)病毒復(fù)制的影響，將PCAGGS-HA-pIRF1轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)IRF1對(duì)PRV和TGEV復(fù)制的影響，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)

7、IRF1可顯著抑制PRV和TGEV的復(fù)制，其中PRV的病毒滴度降低了近10倍，TGEV的病毒滴度降低了20倍以上，表明豬IRF1能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞的抗病毒感染應(yīng)答反應(yīng)，具有較強(qiáng)的抗病毒活性。
　　3.穩(wěn)定表達(dá)豬IRF1基因PK-15細(xì)胞系的建立
　　為構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬IRF1基因的PK-15細(xì)胞系，利用PiggyBac真核轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將豬源IRF1基因轉(zhuǎn)染入PK-15細(xì)胞中，通過(guò)嘌呤霉素和綠色熒光進(jìn)行雙重篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，