Sp1、IRF1和IRF2調(diào)控載脂蛋白L1的表達.pdf

1、目的：本課題主要是深入研究Sp1、IRF1和IRF2調(diào)控載脂蛋白L1基因表達的機制。
　　方法：提取細胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR的方法，擴增IRF2全長基因片段，將其克隆到pflag-cmv-2表達載體上,命名為pFLAG-IRF2。其它反式作用因子由博尚生物技術(shù)有限公司合成，并分別命名為pFLAG-Sp1,pFLAG-Sp3,pFLAG-KLF4,pFLAG-KLF6,pFLAG-IRF1,pFLAG-IRF3,pF

2、LAG-IRF9。將各反式作用因子與啟動子通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法導入細胞，48小時后利用雙熒光素酶報告檢測試驗檢測熒光值,通過此方法初步篩選出可能的反式作用因子Sp1、IRF1及IRF2。在此基礎(chǔ)上進行電泳遷移率實驗,若核蛋白能與探針結(jié)合，其在非變性凝膠上的電泳速度會減慢，從而形成阻滯帶，若再與抗體結(jié)合，其速度會進一步減慢，形成超阻滯帶。通過電泳遷移率競爭實驗及超阻滯試驗進一步確認了Sp1和IRF2能與該啟動子區(qū)域直接結(jié)合。由于細胞中IRF

3、1表達量低,在首次超阻滯實驗中，IRF1并未出現(xiàn)超阻滯條帶。提取經(jīng)過INF-γ干預48小時后的細胞核蛋白，并經(jīng)Western Blot確定IRF-1表達量增加后，再進行超阻滯試驗，出現(xiàn)了超阻滯條帶，證實了IRF-1也可以與該啟動子區(qū)域直接結(jié)合。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建pFLAG-IRF2表達克??；2.過表達pFLAG-Sp1及pFLAG-IRF1、pFLAG-IRF2增加ApoL1的啟動子活性；3.INF-γ能促進IRF1的表達增