豬IRF1抗病毒功能的初步研究及穩(wěn)定表達豬IRF1基因PK-15細胞系的構(gòu)建.pdf

1、干擾素調(diào)節(jié)因子(IFN regulatory factors，IRFs)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與機體免疫應答、炎癥反應、腫瘤發(fā)生以及細胞凋亡等多種生物學過程。其中，IRF3和IRF7在干擾素的表達調(diào)控中起重要作用，參與機體抗病毒免疫應答。近年來研究發(fā)現(xiàn)除IRF3和IRF7之外，IRF1在抗病毒免疫應答中也發(fā)揮著重要作用。IRF1可能是IRF3和IRF7之外的另一種調(diào)節(jié)抗病毒免疫的轉(zhuǎn)錄因子，而且當IRF3/7或IFNs的功能被抑制時，I

2、RF1可能為調(diào)節(jié)干擾素(IFNs)和干擾素激活基因(ISGs)的表達提供了備選機制。對于控制那些能夠拮抗IRF3和IRF7以及IFNs表達的病毒而言，IRF1介導的抗病毒應答可能發(fā)揮著極其重要的作用。目前，豬IRF1的研究相對較少，其具有怎樣的功能特點，特別是在豬抗病毒先天免疫過程中的作用如何尚不清楚。因此，本文開展了以下研究，以期更多了解豬IRF1在機體先天性抗病毒免疫機制中的作用。
　　1.豬IRF1基因的體內(nèi)表達分析及病毒感

3、染對其表達的影響向
　　為研究豬IRF1基因的組織分布，采集健康成年豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腦等組織，通過熒光定量PCR檢測各組織中IRF1基因的表達量。結(jié)果表明IRF1在所有檢測組織中均有表達，其中脾臟中表達量最高，其次是淋巴結(jié)和肝臟，而在心臟、腦和膀胱等其他組織中表達量較低。IRF1在脾臟和淋巴結(jié)等免疫相關組織中表達量較高，提示其可能參與機體的免疫應答。為進一步研究病毒感染狀態(tài)下IRF1基因表達的變化，分別選取兩

4、種DNA病毒（豬偽狂犬病毒，PRV;豬細小病毒，PPV）和兩種RNA病毒(豬傳染性胃腸炎病毒，TGEV;豬水泡性口炎病毒，VSV)為代表，分別檢測了PK-15細胞在不同病毒感染后IRF1的表達情況。結(jié)果表明除PRV流行毒株（QXX株）外，其他參試病毒感染均可上調(diào)IRF1基因的表達，表明豬IRF1參與了機體對病毒感染的應答反應。
　　2.豬IRF1對干擾素表達和病毒復制的影響
　　為研究豬IRF1對干擾素表達的影響，從豬外周血

5、淋巴細胞中擴增豬IRF1基因，定向克隆到PCAGGS-HA載體中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒PCAGGS-HA-pIRF1，轉(zhuǎn)染PK-15細胞，過表達豬IRF1基因。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測無刺激狀態(tài)和poly(I∶C)刺激下豬IFN-β的啟動子活性，并通過熒光定量PCR檢測IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明過表達豬IRF1在無刺激的狀態(tài)下即可激活豬IFN-β的啟動子，并上調(diào)IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平。在poly(I∶C)誘導下，過表達IRF1能夠更為顯

6、著的激活IFN-β的啟動子，而且這種激活能力比豬IRF3和豬IRF7的激活能力更強。然而，當通過RNA干擾技術(shù)敲減PK-15細胞中IRF1的表達后，在poly(I∶C)誘導下，IFN-β的表達水平并無顯著變化，說明豬IRF1能促進干擾素的表達，但不是誘導干擾素表達的必要因子。
　　為探索豬IRF1對病毒復制的影響，將PCAGGS-HA-pIRF1轉(zhuǎn)染PK-15細胞，分別檢測過表達IRF1對PRV和TGEV復制的影響，結(jié)果顯示過表達

7、IRF1可顯著抑制PRV和TGEV的復制，其中PRV的病毒滴度降低了近10倍，TGEV的病毒滴度降低了20倍以上，表明豬IRF1能夠促進體外培養(yǎng)細胞的抗病毒感染應答反應，具有較強的抗病毒活性。
　　3.穩(wěn)定表達豬IRF1基因PK-15細胞系的建立
　　為構(gòu)建穩(wěn)定表達豬IRF1基因的PK-15細胞系，利用PiggyBac真核轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將豬源IRF1基因轉(zhuǎn)染入PK-15細胞中，通過嘌呤霉素和綠色熒光進行雙重篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化細胞，