膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌3016全基因組測(cè)序及菌種水平特異分子標(biāo)識(shí)的篩選和鑒定.pdf

1、膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）是微生物肥料廣泛應(yīng)用的功能菌種之一，菌體自身通過(guò)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸、多糖、激素等物質(zhì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，并且能夠分解含鉀礦物，釋放出鉀及其他營(yíng)養(yǎng)元素，有些菌株還具備溶磷和固氮功能。膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)出提高土壤速效鉀與速效磷含量、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)等多方面的效應(yīng)，一直是微生物肥料研發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。
　　 本論文以實(shí)驗(yàn)室分離得到14

2、株膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀(guān)察、生理生化測(cè)定、16SrDNA和gyr B基因測(cè)序、系統(tǒng)發(fā)育分析。通過(guò)溶磷、解鉀、固氮等生物學(xué)功能的測(cè)定比較，從中篩選得到了一株高效多功能優(yōu)良菌株，編號(hào)為P.Mucilaginosus 3016。該菌株的溶磷、解鉀效果分別比對(duì)照增加至187.8％和131.4％，固氮酶活性為3.51nmol（C2H4）/h·mg（蛋白），發(fā)酵液中產(chǎn)生的蘋(píng)果酸和乙酸分別比對(duì)照增加89.9％和277.7％，同時(shí)產(chǎn)生

3、少量檸檬酸（3.74mg/L）、生長(zhǎng)素（0.03mg/L）和赤霉素（1.01mg/L），對(duì)植株具有一定的促生能力。
　　 采用Sanger測(cè)序方法與454高通量測(cè)序相結(jié)合的方法，對(duì)P.Mucilaginosus 3016菌株全基因組序列進(jìn)行測(cè)序，利用SOAP de novo v1.04、454 Newbler v2.3軟件進(jìn)行序列的拼接，獲得全基因組序列精細(xì)圖譜。通過(guò)基因組序列拼接、空缺填補(bǔ)和低質(zhì)量序列校驗(yàn)等工作后，繪制了301

4、6菌株全基因組序列圖譜，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)基因組進(jìn)行了注釋。
　　 利用比較基因組學(xué)分析手段，根據(jù)3016菌株全基因組序列，選擇膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌特異性片段為靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物。通過(guò)PCR條件的優(yōu)化和特異性、靈敏度的驗(yàn)證，篩選得到一對(duì)膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌的特異引物（orf06701-F：5'-ATGGAGGAAACATG GGGTGA-3'/orf06701-R：5'-TCAGGAATGAAGGCCCCCTT-3'），建立了膠質(zhì)類(lèi)

5、芽孢桿菌快速鑒別方法。研究表明，該引物僅能在以膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌為模板時(shí)特異性擴(kuò)增333bp保守序列，其檢出靈敏限度為每微升反應(yīng)體系400-1000個(gè)細(xì)胞，以實(shí)驗(yàn)選取的其他參比菌株為模板時(shí)并不能擴(kuò)出該序列，該引物具有良好的特異性；同時(shí)，用該方法成功地鑒定了從土壤中分離得到的膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌，并且得到的特異性片段序列同源性達(dá)到100％。
　　 本文對(duì)一株P(guān).Mucilaginosus 3016進(jìn)行全基因組測(cè)序，該菌株是一株具有溶磷、解鉀