煙草內(nèi)生細(xì)菌Itb57生物學(xué)性狀及其對黑脛病的控制研究.pdf

1、煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,煙草黑脛病是世界上各煙草種植區(qū)重要病害之一。在我國大部分煙草種植區(qū)均有發(fā)生,且在多個省市發(fā)生危害嚴(yán)重。為了迎合工業(yè)上對特色品質(zhì)的需求,生產(chǎn)上所種植的煙草品種有許多抗病性程度不高。目前對黑脛病的控制仍然以化學(xué)藥劑為主,從而導(dǎo)致病原菌抗藥性增強、環(huán)境污染及煙葉重金屬含量超標(biāo)等后果,影響防治效果、生態(tài)安全和人類健康等問題的出現(xiàn)。為此,本文以生態(tài)防治為指導(dǎo)思想,從植物微生態(tài)系統(tǒng)角度,研究內(nèi)生細(xì)菌對煙株根際生態(tài)、植株生理

2、生化和病原菌等方面的綜合作用,并以此來控制煙草黑脛病害。主要研究結(jié)果如下:
　　 內(nèi)生細(xì)菌對煙株根際生態(tài)的影響10個內(nèi)生細(xì)菌菌株在3種方式處理后,煙株吸收利用土壤有機(jī)質(zhì)的程度有一定差別,其中菌株Itb295在浸種+灌根處理后土壤有機(jī)質(zhì)含量最高。菌株Itb225、Itb220和Itb57處理后土壤有機(jī)質(zhì)含量與對照最接近;多數(shù)菌株在3種處理方式下土壤pH值與對照處理相比,只是略有變化。其中變化最大的是菌株Itb185在浸種處理后,p

3、H值達(dá)到8.23。相對偏低的是菌株Itb162的浸種處理和Itb28的浸種+灌根處理;各菌株通過浸種+灌根處理后,均能使土壤中全鉀的含量降低,且總體來說,各菌株處理后有利于降低土壤中全鉀含量。而各菌株對煙苗利用速效鉀的影響上表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用,Itb225和Itb28兩個菌株的3種處理均使得速效鉀含量明顯高于對照處理:10個菌株處理后對土壤全磷含量的影響,除菌株Itb220的浸種處理和Itb80的噴霧灌根處理后全磷含量遠(yuǎn)高于對照處理外

4、,其余各處理與對照相比,土壤全磷含量相差不大。而各菌株對土壤中有效磷的影響較大,變化范圍在2.59-18.36 mg/kg,多數(shù)菌株在某種處理方式后可降低土壤中有效磷含量;
　　 各菌株對土壤中過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶這3種與土壤肥力相關(guān)的酶活力影響也沒有明顯一致的趨勢,不同菌株對酶活力影響各有不同。有的菌株可提高某種酶活性,有的也表現(xiàn)出抑制作用;
　　 對土壤微生物類群影響方面,菌株Itb57和Itb12經(jīng)過浸種、浸種

5、十灌根和噴霧灌根這3種方式處理后,土壤中真菌的數(shù)量比其余8個菌株及對照處理要低一個數(shù)量級;菌株Itb57在浸種和浸種+灌根處理后,土壤中細(xì)菌數(shù)量最多,且比對照處理高一個數(shù)量級;10個菌株在3種處理方式下和對照處理一樣,放線菌數(shù)量均在同一個數(shù)量級(對數(shù)值范圍為5.1-5.8)。從趨勢上可以看出,與對照相比,多數(shù)菌株處理后能提高土壤中放線菌數(shù)量;對于功能菌群的影響,多數(shù)菌株發(fā)酵液處理后有利于土壤中固氮菌的增長。所有菌株能明顯有利于解磷細(xì)菌繁

6、殖。多數(shù)菌株處理后土壤中解鉀細(xì)菌數(shù)量與對照處理相比波動幅度不大。
　　 內(nèi)生細(xì)菌對煙株生長的影響10個內(nèi)生細(xì)菌菌株發(fā)酵液對煙草幼苗在地上部鮮重、干重、最大葉長寬和真葉數(shù)等4個方面各有不同程度的影響,其中Itb57對煙苗的促生效果較好,其次是Itb185和Itb295。而菌株Itb162在浸種處理方式下對煙苗的地上部干重和真葉數(shù)兩個方面有明顯的不利影響。1O個內(nèi)生細(xì)菌菌株發(fā)酵液在浸種、浸種+灌根和噴霧灌根3種處理方式下,浸種+灌根

7、處理對煙苗的促生效應(yīng)較好且相對穩(wěn)定,而浸種處理下部分菌株有抑制煙苗生長的作用。
　　 重點研究內(nèi)生細(xì)菌選擇對10個菌株進(jìn)行綜合評價,菌株Itb57對促進(jìn)土壤礦化及植株對養(yǎng)分的利用相對較優(yōu),對土壤3種酶活性無明顯影響,可顯著降低土壤中真菌數(shù)量,提高細(xì)菌數(shù)量,尤其能提高固氮、解磷和解鉀3大功能細(xì)菌數(shù)量,且對煙苗的促生效應(yīng)最好。故將內(nèi)生細(xì)菌Itb57作為重點研究對象,以煙草黑脛病菌YBX1-4菌株作為測定拮抗活性的標(biāo)準(zhǔn)病原菌株。菌株I

8、tb57的抗菌作用及代謝產(chǎn)物內(nèi)生細(xì)菌Itb57具有廣譜的拮抗活性,對供試的煙草赤星病菌等9種植物病原真菌均有一定程度的的拮抗作用。其中對煙草赤星病菌、番茄早疫病菌的抑菌作用最好,抑菌帶寬分別為9.83 mm和9.50 mm。其次是對花生黑斑病菌的抑制作用,達(dá)9.33 mm。并且對煙草上的炭疽病菌、灰霉病菌和白絹病菌也有較好的效果。對煙草黑脛病菌的拮抗研究表明,對峙培養(yǎng)后使得病菌菌絲扭曲、分支增多,有的菌絲上形成小瘤狀物,多數(shù)菌絲變成短粗

9、的結(jié)節(jié)。代謝產(chǎn)物試驗表明菌株Itb57可以產(chǎn)生纖維素酶,蛋白酶,嗜鐵素,不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。菌株Itb57的分類地位結(jié)合菌株菌落性狀、形態(tài)特征和生理生化性狀及16S rDNA序列比對分析,確定Itb57菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。獲得菌株Itb57的16S rDNA片斷序列長度為1397bp,在GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊登錄號(Accession No)為GQl53538。菌株Itb57對煙苗生理生化影響菌株It

10、b57發(fā)酵液原液和離心后的上清液可完全抑制煙草種子萌發(fā),而一定濃度的菌懸液能促進(jìn)種子萌發(fā)和幼芽生長,當(dāng)菌懸液濃度為3×107cfu/ml。時處理最佳。菌株Itb57還能促進(jìn)煙株根系生長發(fā)育,提高根系活力。菌懸液處理煙苗后能明顯提高植株與抗性相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶的活性,但誘導(dǎo)抗性酶活提高的時間段及增強比例有一定差別。菌株Itb57的內(nèi)生定殖研究通過利福平標(biāo)記菌株Itb57,獲得抗Rif200μg/mI。的突變株,突

11、變菌株接種后從煙株體內(nèi)回收菌株的培養(yǎng)性狀和對黑脛病菌的拮抗能力與Itb57基本相同,證明Itb57為內(nèi)生菌株。研究也發(fā)現(xiàn),用其菌懸液處理植株根部,可在莖葉中分離獲得,表明菌株還能在植株內(nèi)從下到上轉(zhuǎn)移,且菌落計數(shù)表明菌株Itb57在植株各組織中的含菌量以根部最多,為3.72×104cfu/g FW,莖中次之,為2.14×104cfu/g FW,葉片中最少,為0.15×104cfu/g FW。經(jīng)無菌培養(yǎng)后的煙苗接種菌株Itb57,通過掃描電

12、鏡和透射電鏡可觀察到菌株Itb57不僅能在植株根表定殖且能進(jìn)入煙草植株中在皮層細(xì)胞內(nèi)定殖,進(jìn)一步證明了菌株Itb57的內(nèi)生性。
　　 菌株Itb57的生物學(xué)特性及發(fā)酵條件培養(yǎng)基篩選試驗表明,以花生粉為原料最有利于菌株Itb57生長繁殖和產(chǎn)生拮抗物質(zhì)。菌株生長曲線表明,Ith57在0-12h生長較為緩慢,數(shù)量增加幅度較小,隨后進(jìn)入對數(shù)生長期,菌體數(shù)量快速增加,到48 h達(dá)到最大數(shù)量,隨后菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株發(fā)酵條件單因素測定表

13、明,菌株Itb57生長和抑制黑脛病菌的拮抗物質(zhì)產(chǎn)生的最適條件是:發(fā)酵溫度為28℃、培養(yǎng)液初始pH值為7.0、發(fā)酵時間為48h、搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min和25 mL/500 mL三角瓶裝液量。正交試驗優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件組合是發(fā)酵溫度為28℃、培養(yǎng)液初始pH值為7.0、時間72 h、搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min和25 mL/500 mL三角瓶裝液量。
　　 菌株Itb57對黑脛病的防治效果 Itb57發(fā)酵液對煙草黑脛病的溫室防治效果