煙草黑脛病多功能生防菌劑的研制.pdf

1、本文針對煙草生產(chǎn)上危害嚴(yán)重的煙草黑脛病篩選獲得了具有抗病、促生長的多個生防菌，并對其生防菌的分類、菌種的選育、搖瓶發(fā)酵條件、抗菌物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)分析、生防菌的劑型、定殖規(guī)律和生防菌劑抗病促生長的作用機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并研制出了多功能生防菌劑。結(jié)果如下：1.從云南、福建等煙草黑脛病病區(qū)土壤中分離得到232株能產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，通過對峙培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、離體葉片處理及盆栽試驗，篩選出對煙草黑脛病菌及其它病原菌有抑制作用的生防細(xì)菌4株，即B

2、6、B8、B16和B925。通過解鉀、解磷及促生長試驗篩選出1株多功能硅酸鹽細(xì)菌B925。 2.在形態(tài)學(xué)和生理生化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)方法對上述篩選到的生防菌進(jìn)行分類鑒定，明確了生防細(xì)菌B6、B8和B925的分類地位，并首次報道了側(cè)孢短芽孢桿菌對煙草黑脛病菌的抑制作用。測定了B6、B8和B925的16SrRNA序列及B6菌株的16S-23SrRNAISR序列。研究結(jié)果表明B6為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtili

3、s)，B8為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)，B925為膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)。 3.通過自然選育和紫外誘變的方法獲得了遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。對兩菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和芽孢量的搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了B6和B925的最佳發(fā)酵配方。B6的發(fā)酵配方為：大豆粉10g/L，蔗糖3g/L，NaCl5g/L，NH4NO35g/L。最佳搖瓶培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基起始pH7.0

4、～8.0，培養(yǎng)溫度為28～30℃，裝液量為50ml/250ml三角瓶，最佳初始接種量為5％，轉(zhuǎn)速為160～180r/min，發(fā)酵時間為36～40h。菌株B925的最佳產(chǎn)芽孢發(fā)酵配方為：甘露醇17.5g/L；硝酸鉀7.9g/L；花生餅粉7.3g/L；MgSO4·7H2O3.2g/L；K2HPO40.85g/L；CaCO33.0g/L；FeCl30.023g/L和最佳產(chǎn)生抗菌物質(zhì)配方為：蔗糖15～20g/L；花生餅粉15g/L；MgSO4·

5、7H2O3.2g/L；K2HPO40.85g/L；CaCO33.0g/L；FeCl30.023g/L。搖瓶發(fā)酵初始最適pH值6.5～7.5，裝液量為30～50ml，種齡以3d為宜。 4.明確了抗菌物質(zhì)的理化性質(zhì)，分離純化得到了兩種抗菌蛋白和生物表面活性素，初步明確了生物表面活性素的化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)。采用硫酸銨沉淀、分子截留、PharmadexLH-20精制得到兩種較耐熱的抗菌蛋白，分子量分別為17,560D和13,200D。利用鹽

6、酸沉淀，有機(jī)溶劑浸提，TLC分離、PharmadexLH-20精制獲得生物表面活性素純品。紫外吸收光譜測定表明該生物表面活性素在210nm處有吸收峰；紅外光譜表明生物表面活性素存在-OH、-NH2、-C=O、-CH2、-COOR的伸縮振動；經(jīng)化學(xué)分析表明該生物表面活性素為一種環(huán)狀脂肽類物質(zhì)；液質(zhì)聯(lián)用測定表明生物表面活性素的有效活性成分的分子量為1080Da，另外還含有2個結(jié)構(gòu)近似的同系物，分子量只差14(-CH2)，分子量為1035Da

7、和1021Da；氨基酸分析表明該生物表面活性素含有4個Leu、1個Asp、1個Glu和1個Val，與目前報道的脂肽類生物表面活性素有所不同。 5.對煙草黑脛病的多功能生防菌劑的劑型進(jìn)行了初步研究。采用硅藻土為吸附劑吸附生防菌芽孢混配成多功能芽孢粉劑SN-01，利用B6發(fā)酵液除菌、減壓濃縮制成SN-02水劑，兩菌劑均具有較好的穩(wěn)定性。 6.采用Rif+Str雙抗標(biāo)記B6及Km標(biāo)記B925研究了兩菌在土壤中的定殖規(guī)律及對土壤

8、中微生物的影響。結(jié)果表明兩生防菌均可以在煙株根際、根表定殖，但不能進(jìn)入煙株體內(nèi)生活。兩菌混合施用相互之間無明顯的拮抗作用。生防菌進(jìn)入土壤中均表現(xiàn)為先增后減的趨勢，在10～15d達(dá)到繁殖高峰，在土壤中維持抗病促生作用可達(dá)一個月之久。生防菌施入后能增加煙株根際土壤中真菌、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，且對化學(xué)農(nóng)藥具有較強(qiáng)的耐藥性，可以和部分化學(xué)農(nóng)藥共同使用。 7.深入研究了生防菌劑防治病害的作用機(jī)理。明確了生防菌劑SN-02抗病信號通路為水楊

9、酸途徑，在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)PR1基因表達(dá)，在翻譯水平誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白產(chǎn)生及提高寄主防御酶系的酶活，從而誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生抗病性。利用RealtimePCR分析了SN-02誘導(dǎo)PR1基因的定量表達(dá)，結(jié)果表明SN-02水劑處理誘導(dǎo)PR1基因表達(dá)量出現(xiàn)兩次高峰，其中處理84h誘導(dǎo)表達(dá)量最高，且直到處理7d誘導(dǎo)PR1基因的表達(dá)量仍然保持較高的水平。這表明SN-02水劑誘導(dǎo)的抗病性具有持續(xù)性。接種煙草黑脛病菌及用SN-02處理后接種的處理也可誘導(dǎo)PR1基因

10、表達(dá)，且后者能顯著提高PR1基因的相對表達(dá)量。SN-02水劑處理煙草后還可以誘導(dǎo)煙株體內(nèi)產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白及煙株體內(nèi)的PPO、POD、PAL、SOD、CAT的酶活增高。 明確了生防菌及生防菌劑促進(jìn)煙草生長的作用機(jī)理。無論是液體培養(yǎng)，還是砂土培養(yǎng)，都表明B925具有分解土壤中多種硅酸鹽礦物的能力，將硅酸鹽礦物中鉀、磷等元素轉(zhuǎn)化為可浸提的形態(tài)，提高對植物的有效性。水培及土培試驗結(jié)果表明各生防菌及菌劑均可促進(jìn)煙株生長，增加生物量，還可提