棗瘋病植原體的分子檢測(cè)及鑒定.pdf

1、棗樹(shù)原產(chǎn)我國(guó)，屬于我國(guó)的特產(chǎn)果樹(shù)。近年來(lái)，我國(guó)棗樹(shù)的栽培面積不斷擴(kuò)大，使得棗產(chǎn)業(yè)在新疆果業(yè)中占有一定分量。然而，在生產(chǎn)上對(duì)棗樹(shù)及果品影響的因素有很多，其中棗瘋病是棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。棗瘋病被稱為棗樹(shù)的癌癥，具有毀滅性，目前雖然出現(xiàn)一些治愈方法，但是其效果不太明顯。本文基于以往的研究基礎(chǔ)，根據(jù)Lee設(shè)計(jì)的通用引物R16mF1/R16mR1對(duì)植原體16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得其目的片段，通過(guò)BLAST比對(duì)，DNAman 軟件分

2、析，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選適合的引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系及條件，建立了棗瘋病植原體的檢測(cè)體系。利用該檢測(cè)體系，對(duì)新疆部分主栽品種進(jìn)行帶病情況調(diào)查。具體研究的內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1．根據(jù)植原體16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1，對(duì)陜西和山西具有棗瘋病植株的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，分別得到1432bp和1433bp的兩條序列，DNAman分析比對(duì)結(jié)果表明二者同源性為99.37%。挑選27條關(guān)

3、于16S rDNA具有明確分組的植原體序列，進(jìn)行同源性分析，以此為基礎(chǔ)，選擇17種具有16S rDNA分組的典型的限制性內(nèi)切酶，通過(guò)pDRAW32軟件計(jì)算機(jī)模擬RFLP，結(jié)果表明棗瘋病植原體的酶切圖譜都一致，與其他組的酶切圖譜均存在差異，其中最大的為9處差異，最小的為3處差異。分析同源性并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明來(lái)自陜西和山西的棗瘋病植原體的16S rDNA片段和16S rDNA V-B組的遺傳距離最近，應(yīng)該劃分到16S rDNA V-

4、B組中。故確定棗瘋病植原體16S rDNA屬于16S rDNA V-B。
　　 2．對(duì)獲得的16S rDNA序列，通過(guò)BLAST獲得與其相似的序列99條，DNAman軟件分析其同源性，得到棗瘋病植原體的保守序列，運(yùn)用Primer 5.0針對(duì)保守序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用BLAST檢測(cè)這些引物，是否只擴(kuò)增植原體16S rDNA，剔除可以擴(kuò)增出其他菌體的引物序列，篩選出只擴(kuò)增植原體序列的NTF1/NTR1、NTF2/ NTR1、NTF3/N

5、TR1、NTF1/NTR2、NTF2/NTR2和NTF3/NTR2六對(duì)引物序列，確保實(shí)驗(yàn)不出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選，挑出適宜的PCR檢測(cè)體系的引物NTF1/ NTR1、NTF1/NTR2、NTF2/NTR2、NTF3/NTR2四對(duì)，克隆測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增片段，證明所檢測(cè)到的植原體均符合預(yù)測(cè)結(jié)果，并均屬于棗瘋病植原體的16S rDNA片段，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)棗瘋病植原體總DNA稀釋10-50倍，發(fā)現(xiàn)總DNA濃度在該范圍內(nèi)對(duì)該檢測(cè)

6、體系幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明檢測(cè)的靈敏性比較好，可以很好地用于棗瘋病植原體的檢測(cè)。
　　 3．利用建立起來(lái)的棗瘋病植原體PCR檢測(cè)體系，對(duì)在新疆采集的梨棗，灰棗，金絲小棗，冬棗和駿棗等樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在喀什地區(qū)采集的有棗瘋病癥狀的駿棗樣品中存在有植原體，在庫(kù)爾勒地區(qū)采集的無(wú)棗瘋病癥狀的部分駿棗和脆棗樣品中也被檢測(cè)出有植原體存在。因此，要求我們必須對(duì)新疆棗瘋病病情進(jìn)行深入的調(diào)研，搞清疆內(nèi)棗樹(shù)攜帶植原體的情況，確保棗樹(shù)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。