CcRPⅡ基因轉(zhuǎn)化圓紅大棗抗棗瘋病研究.pdf

1、我國(guó)是棗樹的起源地和栽培中心，種質(zhì)資源非常豐富，棗樹是我國(guó)第七大果樹和第一大干果樹，棗果尤其是鮮食果的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值很高，被喻為“二十一世紀(jì)的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種”。棗瘋病是棗樹生產(chǎn)上的一種具有毀滅性的侵染性病害，幾乎分布于國(guó)內(nèi)外所有的棗樹栽培區(qū)。目前還沒有較好治療棗瘋病的辦法，其中篩選和培育抗棗瘋病品種或品系是解決棗瘋病的重要途徑之一，作為利用傳統(tǒng)的雜交育種方法很難較快地得到抗病品種，近十幾年來，國(guó)內(nèi)外迅速發(fā)展的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在果樹育種中得到

2、了廣泛的應(yīng)用，并且已經(jīng)取得了長(zhǎng)足發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為果樹品種改良最有前途的技術(shù)方法之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在農(nóng)作物上取得了令人鼓舞的成績(jī)，但是在果樹上應(yīng)用的研究卻極少，由于果樹育種周期長(zhǎng)，不斷地摸索試驗(yàn)快速有效的育種方法是很有意義的。本研究對(duì)圓紅大棗進(jìn)行了抗病基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究，并成功將香樟RIPCcRIPⅡ基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)化入圓紅大棗中，并對(duì)組培苗進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，其主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.再生體系的建立。BA對(duì)愈傷

3、組織顏色、新生側(cè)芽個(gè)數(shù)影響最大，NAA對(duì)新側(cè)芽生長(zhǎng)、愈傷組織大小影響最大；KT對(duì)新生側(cè)芽個(gè)數(shù)、新側(cè)芽伸長(zhǎng)生影響力一般，對(duì)愈傷組織大小影響最小；MS+BA1.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.01mg/L培養(yǎng)基配方最利于新生側(cè)芽增殖；MS+BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.01mg/L培養(yǎng)基配方有利于愈傷組織增大；MS+BA3.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.05mg/L培養(yǎng)基配方最利于側(cè)芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

4、r>　　 2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)CcRIPⅡ基因轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。選取部位為莖段，DNA菌液原液或1/2原液濃度，浸染10min或20min，培養(yǎng)平均分化數(shù)值最大，為2.4個(gè)芽和1.7個(gè)芽；選取部位為莖尖，DNA菌液為1/2原液或原液濃度，浸染15min-20min，平均苗高較高分別為1.31cm和1.15cm；全綠苗率也較高，分別達(dá)62.5％和75.5％。
　　 3.采用L9(34)正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)立農(nóng)桿菌浸染部位、浸染時(shí)間以及DNA濃

5、度三個(gè)影響轉(zhuǎn)化效果的重要因子進(jìn)行了分析比較，結(jié)果表明，采用1/3原液濃度的菌液浸染莖尖20min，轉(zhuǎn)化效果最佳。
　　 4.對(duì)獲得的圓紅大棗轉(zhuǎn)基因苗，進(jìn)行PCR分子驗(yàn)證，有10株檢測(cè)陽性，表明外源CcRIPⅡ基因已整合到圓紅大棗基因組內(nèi)。
　　 5.轉(zhuǎn)基因植株抗病能力分子鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株未發(fā)現(xiàn)棗瘋病植原體標(biāo)記產(chǎn)物的陽性表達(dá)，未轉(zhuǎn)基因植株有3株出現(xiàn)叢枝病陽性表達(dá)，病毒感染率達(dá)到15.0％，說明轉(zhuǎn)基因植株較未轉(zhuǎn)基因植