奶山羊乳腺能量代謝研究.pdf

1、乳腺發(fā)育狀況是決定乳產(chǎn)量的重要因素之一。適當(dāng)?shù)哪芰抗?yīng)對(duì)乳腺發(fā)育至關(guān)重要，營(yíng)養(yǎng)匱乏或營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩都將影響乳腺的正常發(fā)育。目前尚缺乏對(duì)乳腺發(fā)育、泌乳及退化各個(gè)時(shí)期能量代謝的全面研究和乳腺能量代謝調(diào)控的基礎(chǔ)研究。
　　 本研究以奶山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)乳腺組織發(fā)育各時(shí)期能量代謝相關(guān)途徑關(guān)鍵酶的活性。結(jié)果表明：己糖激酶（hexokinase，HK）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，ICDH）和ATP酶在妊娠

2、期活性升高，泌乳期活性保持在較高的水平，泌乳35日達(dá)到最大值，乳腺退化后活性降低，HK、ICDH和ATP酶在妊娠期和泌乳期活性升高，表明乳腺組織中能量代謝上調(diào)；肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（Carnitine palmitoyltransferase，CPT）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，G6PDH）活性在泌乳期活性升高，泌乳35日達(dá)到最大值，乳腺退化后活性降低，在泌乳期CPT活性升高，表

3、明乳腺利用脂肪酸氧化供能。
　　 本研究采用高效液相色譜檢測(cè)奶山羊乳腺發(fā)育各時(shí)期乳腺中腺苷酸含量及能荷。結(jié)果表明：妊娠期腺苷酸含量增加，泌乳啟動(dòng)后腺苷酸含量急劇升高，泌乳期保持較高的水平，泌乳35日含量達(dá)到最大值，乳腺退化后含量下降。除泌乳35日以外，乳腺發(fā)育各時(shí)期能荷維持在0.5～0.9之間，泌乳35日的能荷值為0.3。
　　 本研究采用熒光定量PCR、Western blotting和激光掃描共聚焦顯微技術(shù)首次對(duì)奶山

4、羊乳腺發(fā)育、泌乳及退化各個(gè)時(shí)期乳腺中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter-1，GLUT1）mRNA水平和蛋白水平表達(dá)及GLUT1蛋白定位進(jìn)行系統(tǒng)研究。結(jié)果表明：在乳腺發(fā)育各時(shí)期GLUT1mRNA水平和蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)相似，呈顯著正相關(guān)。青春期，乳腺中GLUT1 mRNA和蛋白的表達(dá)較低；妊娠期開(kāi)始升高，妊娠35日乳腺中GLUT1 mRNA和蛋白表達(dá)最高，并在整個(gè)泌乳期維持在高水平；幼仔離乳后，乳腺上皮細(xì)胞凋亡，GLU

5、T1 mRNA和蛋白表達(dá)下降。青春期和妊娠早期，GLUT1主要在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞被檢測(cè)到；妊娠晚期和泌乳期，GLUT1存在于腺泡上皮細(xì)胞靠近基底側(cè)和細(xì)胞外基質(zhì)中；退化期，GLUT1在腺泡上皮細(xì)胞中被檢測(cè)到。這些結(jié)果表明在乳腺發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，乳腺通過(guò)GLUT1吸收葡萄糖為乳腺的發(fā)育和和泌乳提供能量。
　　 為了探討乳腺能量代謝調(diào)控機(jī)制，（1）采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)調(diào)控能量代謝蛋白激酶AKT及其下游作用物HKⅡ和乳酸脫氫酶（la

6、ctate dehydrogenase，LDH）基因在奶山羊乳腺發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示：在泌乳期A(yíng)KT、HKⅡ和LDH基因高表達(dá)，泌乳35日表達(dá)最高。AKT激活后可通過(guò)促進(jìn)糖酵解和氧化磷酸化提高細(xì)胞內(nèi)ATP水平。泌乳期A(yíng)KT、HKⅡ和LDH基因高表達(dá)提示AKT對(duì)乳腺能量代謝調(diào)控。（2）采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)調(diào)控能量代謝的AMP依賴(lài)性蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路基因LKB1

7、、AMPKα2和AMPKβ1在奶山羊乳腺發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示：LKB1、AMPKα2和AMPKβ1在泌乳1日、泌乳35日和泌乳60日高表達(dá)，與其他時(shí)期差異均顯著。乳腺在分娩后啟動(dòng)泌乳，此時(shí)能量需求激增，泌乳35日和泌乳60日乳腺處于泌乳高峰期，需要大量ATP來(lái)合成乳汁，AMPK信號(hào)通路基因在這兩個(gè)時(shí)期高表達(dá)提示AMPK可能參與乳腺細(xì)胞能量代謝調(diào)控。
　　 為了研究AMPK對(duì)乳腺細(xì)胞代謝的影響，在乳腺細(xì)胞培養(yǎng)液中添加AMPK

8、激活劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside，AICAR），培養(yǎng)15min、30min和60min后檢測(cè)AMPK激活后對(duì)乳腺細(xì)胞糖代謝、脂代謝和蛋白質(zhì)合成的影響。結(jié)果顯示：培養(yǎng)15min、30min和60min的激活組和對(duì)照組AMPK活性差異顯著（p<0.05），培養(yǎng)液中添加AICAR提高AMPK活性。激活組與對(duì)照組相比葡萄糖吸收顯著增多（p<0.01），GLUTI

9、 mRNA表達(dá)升高（p<0.05），糖原合成酶（glycogen synthase-1，GYS1）mRNA表達(dá)下降（p<0.05）；激活組與對(duì)照組相比CPT1mRNA表達(dá)升高（p<0.05），脂肪酸合成酶（fattyacid synthase，F(xiàn)AS）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coa carboxylase-1，ACC1）mRNA表達(dá)下降（p<0.05）；激活組與對(duì)照組相比核糖體蛋白S6激酶（ribosomal protein