柔嫩艾美耳球蟲EtMic2蛋白與雞IL-18共表達(dá)核酸疫苗的研究.pdf

1、雞球蟲病是一種危害嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲病，對全世界的養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雞球蟲病的防治主要是依靠化學(xué)藥物和活球蟲疫苗的使用(Shirley et al.，2005)，然而隨著化學(xué)藥物的使用，藥物殘留、抗藥性蟲株的產(chǎn)生以及人們對動物性食品藥物殘留的擔(dān)心等諸多問題隨即而生，而開發(fā)新的化學(xué)藥物成本又高，同時弱毒球蟲疫苗的應(yīng)用因具有致病性、生產(chǎn)成本高、可能產(chǎn)生“返祖”的現(xiàn)象等弊端而影響?zhàn)B雞業(yè)生產(chǎn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新型疫苗的應(yīng)用研究越來

2、越深入。核酸疫苗具有可靠的安全性，較高的穩(wěn)定性，便于生產(chǎn)和運(yùn)輸，生產(chǎn)成本低，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答等諸多優(yōu)點(diǎn)。柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2(EtMic2)是由球蟲頂復(fù)合器微線體分泌的多種蛋白質(zhì)之一，已有研究表明，EtMic2蛋白在雞球蟲入侵時起著重要的作用(Kawazoe et al.，1992)。雞IL-18(ChIL-18)是一種具有多向和多層次免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，能刺激產(chǎn)生Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫

3、，在宿主防御、抑瘤抗瘤、抗變態(tài)反應(yīng)等方面具有重要作用，是一種良好的免疫增強(qiáng)劑。本研究將柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2基因(EtMIC2)單獨(dú)和與作為免疫增強(qiáng)劑的ChIL-18基因串聯(lián)插入到pVAX1真核表達(dá)載體中構(gòu)建DNA疫苗，并檢測其對Etenella攻蟲的保護(hù)作用。試驗(yàn)具體分為以下幾個部分:
　　1.ChIL-18蛋白的表達(dá)純化及多克隆抗體的制備
　　將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-IL-18在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，重組質(zhì)

4、粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)驗(yàn)證表達(dá)后，進(jìn)行大量表達(dá)并用Ni柱進(jìn)行ChIL-18蛋白的純化。將純化后的ChIL-18蛋白三次免疫BALB/c小鼠進(jìn)行多克隆抗體的制備。通過間接ELISA方法測定抗ChIL-18抗體的效價后，將采取并分離的血清作為多克隆抗體使用。
　　2.核酸疫苗重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)
　　利用DNA重組技術(shù)，分別構(gòu)建了核酸疫苗pVAX1-MIC2，pVAX1-IL-18和pVAX1-MIC2-IL-18。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定

5、正確后，為了驗(yàn)證其在體外的表達(dá)，將構(gòu)建的各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并通過IFA和Western blot方法檢測。為了驗(yàn)證其在體內(nèi)的表達(dá)，將3種DNA疫苗注射到昆明小鼠體內(nèi)，通過檢測小鼠血清中EtMic2和ChIL-18特異性抗體的水平驗(yàn)證其在體內(nèi)表達(dá)。
　　3.重組核酸疫苗的免疫保護(hù)性試驗(yàn)
　　設(shè)立pVAX1-MIC2，pVAX1-IL-18，pVAX1-MIC2-IL-18和pVAX1-MIC2混合pVAX1-IL-1

6、8四個免疫組進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，同時設(shè)立pVAX1.0空質(zhì)粒免疫組和感染非免疫和非感染非免疫對照組，每組20只雛雞。分別將各重組核酸疫苗以100μg/只的劑量于7、14、21日齡三次經(jīng)腿部肌肉注射免疫雛雞。28日齡時，除非感染非免疫組的雞只外的全部雛雞經(jīng)口感染6000個新鮮的E.tenella孢子化卵囊，感染后一周宰殺全部的試驗(yàn)動物，一方面從增重、盲腸病變計(jì)分、卵囊排出量和抗球蟲指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，另一方面進(jìn)行抗體水平檢測、脾淋巴細(xì)胞檢測

7、和細(xì)胞因子水平檢測等。
　　通過兩個方面對構(gòu)建的DNA疫苗進(jìn)行保護(hù)力大小的評價。結(jié)果表明，pVAX1-MIC2，pVAX1-MIC2-IL-18和pVAX1-MIC2混合pVAX1-IL-18免疫組均能增加體重，減輕雞球蟲感染后的盲腸病變和減少卵囊排出量，其中pVAX1-MIC2免疫組的ACI為153，pVAX1-MIC2混合pVAX1-IL-18免疫組的為156，而pVAX1-MIC2-IL-18免疫組的ACI可達(dá)171，可見p