非洲雛鴕鳥消化管的發(fā)育及Ghrelin在其中分布規(guī)律的研究.pdf

1、鴕鳥是世界上現(xiàn)存體形最大的草食性鳥類,具有很高的飼養(yǎng)價值。雛鴕鳥由于機體的各種器官系統(tǒng)尚未發(fā)育完善,抵抗力低,對機體內外環(huán)境的變化和病原的侵襲非常敏感,容易發(fā)病,從而影響其生長。消化管是營養(yǎng)物質消化吸收的重要場所,它的發(fā)育程度決定了動物對營養(yǎng)物質消化吸收的情況,動物對營養(yǎng)物質消化吸收的多少影響動物的生長發(fā)育。非洲鴕鳥育雛期較長,在育雛期間,生長發(fā)育緩慢,胃腸道疾病嚴重。為了提高非洲鴕鳥的育雛率,降低胃腸道疾病的發(fā)病率,科學家們已經對非洲

2、鴕鳥展開了大量的研究。但是到目前為止,有關非洲雛鴕鳥消化道發(fā)育規(guī)律的研究,尚未見過報道。
　　 Ghrelin是由日本科學家Kojima等人于1999年從小鼠的胃中提純并鑒定了的一種促生長激素分泌受體的特定的內源性配體的一種腦腸肽,由胃黏膜分泌,能影響動物的攝食、飲水、消化道的活動以及動物體內其它激素的分泌、從而影響動物的生長發(fā)育。現(xiàn)已證明哺乳動物Ghrelin為28個氨基酸殘基的多肽,禽類的Ghrelin則由26個氨基酸殘基組

3、成的多肽。Ghrelin廣泛分布于多種動物的胃、回腸、腎上腺、心房、乳房、口腔黏膜、食道、輸卵管、脂肪、膽囊、淋巴細胞、腎臟、脾臟、淋巴管、心臟、肺、肌肉、心肌、卵巢、精巢、胎盤、前列腺、胰腺、甲狀腺、皮膚、垂體、血管中,并且它的分布隨著動物年齡的變化而變化,而到目前為止,未見非洲鴕鳥Ghrelin的研究報道。
　　 綜合以上兩個方面的因為,本課題利用石蠟切片HE染色技術、透射電鏡(TEM)技術、組織化學技術、免疫組化技術定位表

4、達(SABC)技術及反轉錄PCR(RT-PCR)技術等綜合手段,從組織、細胞、亞細胞、分子等多層次對雛鴕鳥消化管的形態(tài)結構、發(fā)育特點,Ghrelin的分布發(fā)育規(guī)律進行全面、系統(tǒng)的研究,旨在為非洲鴕鳥胃腸道疾病的預防和治療提供可靠的理論依據。主要研究內容和研究結果包括以下5個方面:
　　 1.非洲鴕鳥消化管的形態(tài)學特點
　　 本試驗以90d健康非洲雛鴕鳥為試驗動物,通過光鏡和電鏡樣本制作,采用大體解剖、石蠟切片、PAS染色

5、、嗜銀染色及HE染色技術,研究雛鴕鳥消化管的形態(tài)學結構。結果顯示:非洲鴕鳥的消化管由口咽腔、食管、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸構成。非洲鴕鳥無嗉囊,其口咽腔,腺胃、肌胃、空腸和結腸比其它禽類的發(fā)達,特別是結腸,位置占據了整個腹腔后半部的大部分；消化管的組織結構從內到外依次分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層；食管有粗大的皺襞,肌層發(fā)達,有發(fā)達的食管腺；腺胃分有腺部和無腺部,在有腺部內,腺體由位于固有膜的單管腺和位于黏

6、膜下層發(fā)達的復管狀腺組成,其中復管狀腺由大量的腺細胞、少量的內分泌細胞和黏液細胞構成；肌胃含有肌胃腺,并且黏膜肌層較明顯,由內縱肌和外環(huán)肌組成；小腸絨毛較長,有分支現(xiàn)象,未見中央乳糜管；十二指腸的固有膜中有發(fā)達的腺體和集合淋巴小結,黏膜下層內無十二指腸腺；從十二指腸到回腸,腸絨毛的匯合及分支現(xiàn)象更加明顯,固有膜內集合淋巴小結的數(shù)量逐漸減少,空腸的絨毛彎曲明顯；具有一對發(fā)達的盲腸；結腸特別發(fā)達,有黏膜皺襞,黏膜上皮為復層柱狀上皮,其間夾有

7、杯狀細胞,腸絨毛短且發(fā)達。非洲鴕鳥消化管的這些形態(tài)學特點,決定了非洲鴕鳥對粗纖維具有很強的消化吸收能力。
　　 2.雛鴕鳥消化管的發(fā)育特點
　　 本研究以1d、45d和90d健康非洲雛鴕鳥為試驗動物,利用大體解剖學、組織化學和形態(tài)計量學的方法,研究雛鴕鳥消化管的發(fā)育特點。研究結果顯示:鴕鳥的體重,消化管的重量和長度隨日齡而增加；食管、腺胃和十二指腸的相對重量在90d達到高峰,肌胃、空腸、回腸以及所有大腸的相對重量在45d

8、達到高峰；腺胃單管腺和復管腺的厚度、肌胃腺的高度、肌胃黏膜肌層的厚度、腸絨毛的高度和寬度,肌層的厚度與日齡呈正相關；腸絨毛的高度與隱窩深度的比值在不同腸段,其變化趨勢也各有差異:在空腸,從1d-90 d比值逐步減少；而在十二指腸和回腸,從1d-45d比值逐步減少,而從45d-90 d比值逐步增加；小腸絨毛杯狀細胞和隱窩杯狀細胞的數(shù)量從1d-45d隨日齡增加而增加,45d-90d隨日齡增加而減少。絨毛杯狀細胞的數(shù)量在1d,空腸最高；45d

9、,回腸最高。隱窩杯狀細胞的數(shù)量在1d和90d時,回腸最高；45d時,十二指腸最高。這些結果揭示非洲鴕鳥消化道的發(fā)育從1d-90d逐步完善；特別是1d-45d,從消化道的重量、長度、腸絨毛的特點以及腸杯狀細胞的變化可以看出其發(fā)育極不完善。因此,在非洲鴕鳥的飼養(yǎng)管理中,應加強1d-45d的飼養(yǎng)管理,在這階段應飼喂易消化且營養(yǎng)全面的日糧,這樣有助于減少雛鴕鳥消化系統(tǒng)疾病。
　　 3.Ghrelin陽性細胞在雛鴕鳥胃腸道的分布及發(fā)育規(guī)律

10、
　　 本研究以1d、45d和90d健康非洲雛鴕鳥為試驗動物,利用免疫組織化學SABC技術對非洲鴕鳥消化管內Ghrelin陽性細胞(Ghrelin-ic)的分布、形態(tài)學特點以及發(fā)育變化進行了研究。結果顯示:Ghrelin-ic分布于整個胃腸道；腺胃,大量的Ghrelin-ic位于黏膜下層的復管腺內,少量的陽性細胞位于黏膜層的單管腺內；肌胃,Ghrelin-ic位于黏膜層的黏膜上皮下陷的漏斗狀的隱窩上皮細胞內；腸道,Ghrelin

11、-ic數(shù)量較胃內少,分布于整個腸道的黏膜層的隱窩和腸絨毛上皮細胞之間,黏膜下層和肌層未見陽性細胞。Ghrelin-ic根據其游離面是否到達腔面可分為兩類,即“開放型”細胞和“閉合型”細胞,在腺胃和肌胃,主要是“閉合型”陽性細胞,“開放型”陽性細胞較少,而在小腸和大腸,主要是“開放型”陽性細胞,“閉合型”陽性細胞較少；Ghrelin-ic分布密度總的來說,在腺胃最高,從十二指腸、空腸、回腸、肌胃、盲腸、結腸到直腸分布密度逐步降低；在腺胃,

12、陽性細胞的數(shù)量從1-45d逐步增加,并且在45d出現(xiàn)一個峰值；在肌胃和小腸,陽性細胞的數(shù)量從1-90d逐步增加,并且在90d出現(xiàn)一個峰值；從90-334d,Ghrelin-ic的數(shù)量在胃和小腸都是逐步增加,但差異不顯著。以上結果說明:Ghrelin-ic在非洲鴕鳥整個胃腸道內有分布,并且其數(shù)量隨著機體的發(fā)育而變化,總的趨勢是:從1-90d,隨著日齡的增加而逐步增加。根據這些變化可以推論,Ghrelin對非洲鴕鳥消化管的發(fā)育起一定的作用。

13、
　　 4.非洲鴕鳥Ghrelin基因的克隆和序列分析
　　 根據GenBank中所公布雞(GeneBank登錄號:AB075215)的Ghrelin核苷酸序列,設計合成一對特異性引物,以45d非洲鴕鳥腺胃組織中總RNA為模板,采用RT-PCR法,擴增出Ghrelin成熟蛋白編碼cDNA序列,將此擴增產物克隆入pMD18-T載體,進行PCR鑒定及序列測定與分析。結果表明:從非洲鴕鳥腺胃中擴增出了Ghrelin基因,擴增產

14、物為191bp；利用DNAMAN將其轉化成氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)非洲鴕鳥Ghrelin的成熟蛋白,由28個氨基酸殘基構成；同一性分析表明,非洲鴕鳥Ghrelin基因與雞、鴨、鵝、火雞、鴯鹋、日本鵪鶉Ghrelin基因相應序列的同一性分別為95％、94％、84％、83％、84％、84％和82％；氨基酸同一性與鴯鹋、雞、鴨、鵝、火雞和鵪鶉分別為88.9％、73％、69.8％、74.6％、73％和68.3％；基因和蛋白氨基酸同一性分析結果說明Ghr

15、elin是一組在進化上高度保守的蛋白質；利用DNAMAN對Ghrelin進行進化樹分析,進一步發(fā)現(xiàn)非洲鴕鳥與鴯鹋的親緣關系最近。非洲鴕鳥Ghrelin成熟蛋白cDNA的成功克隆,為進一步研究非洲鴕鳥Ghrelin全基因結構、基因表達與調控奠定了基礎。
　　 5.Ghrelin基因在非洲雛鴕鳥胃腸道的表達及發(fā)育性變化
　　 根據GenBank中所公布雞(GeneBank登錄號:AB075215)的Ghrelin核苷酸序列,

16、設計合成一對特異性引物,以1d、45d和90d健康非洲雛鴕鳥胃腸道組織中的總RNA為模板,采用RT-PCR法,對Ghrelin mRNA在非洲雛鴕鳥胃腸道的表達及發(fā)育性變化進行了研究。結果表明:Ghrelin mRNA除在空腸、結腸不表達外,在腺胃、肌胃、十二指腸、回腸、盲腸和直腸均有表達；Ghrelin mRNA在胃和小腸組織中的表達隨著日齡的變化而變化:1d時,只在腺胃中表達；45d時,Ghrelin mRNA在腺胃、肌胃及回腸中都