龍眼葉片黃酮類化合物合成關鍵酶基因和DHAR基因cDNA全長的克隆.pdf

1、本研究以‘烏龍嶺’龍眼葉片為材料,采用RT-PCR和RACE技術,克隆出查爾酮合成酶(CHS)和查爾酮異構酶(CHI)基因,以及脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)cDNA的全長。黃酮類化合物合成關鍵酶基因的克隆為進一步利用基因工程技術開發(fā)黃酮類化合物奠定分子生物學基礎。DHAR基因全長的克隆為進一步從分子水平了解植物抗壞血酸氧化還原系統(tǒng)和抗逆作用機制奠定理論基礎。
　　 1.利用RT-PCR和RACE技術克隆龍眼葉片CHS基因全長<

2、br>　　 龍眼葉片CHS基因cDNA全長為1298 bp(GenBank登錄號為JF718282),開放閱讀框為1200 bp,編碼393個氨基酸,分子量42.947 kD,等電點5.90。將龍眼葉片CHS全長經過BLAST軟件比對,該序列與荔枝CHS基因的同源性較高,為96％；其次與白鮮、銀白楊、毛果楊、甜橙、蕓香同源性也比較高,分別為83％、81％、80％、80％、80％；并對其氨基酸序列進行比對發(fā)現,龍眼葉片的CHS蛋白與荔枝

3、、白鮮、銀白楊、葡萄、甜橙、沉香同源性也比較高,均達98％以上。經保守區(qū)功能區(qū)的分析,推導出CHS蛋白擁有兩個保守區(qū)域,CHS-like酶家族和CHS酶家族區(qū)域。CHS蛋白序列經跨膜和二級結構的預測,發(fā)現有一個跨膜區(qū)域,位于365～382位,蛋白結構主要以螺旋和線狀結構為主。
　　 2.利用RT-PCR和RACE技術克隆龍眼葉片CHI基因全長
　　 龍眼葉片CHI基因cDNA全長為1011 bp(GenBank登錄號為J

4、F718281),開放閱讀框為743 bp,編碼246個氨基酸,分子量26.841 kD,等電點5.22。將龍眼葉片CHI全長經過BLAST軟件比對,該序列與荔枝CHI基因的同源性較高,為98％；其次與蜜柑、甜橙、柚子、西洋梨、沙梨同源性也比較高,分別為82％、82％、81％、79％、80％；并對其氨基酸序列進行比對發(fā)現,龍眼葉片的CHI蛋白與沙梨、金花茶、狐臭葡萄、文旦柚、毛果楊、牡丹同源性也比較高,同源性在87％～92％之間。經保守

5、區(qū)功能區(qū)的分析,推導出CHI蛋白擁有一個保守區(qū)域,查爾酮超級家族區(qū)域。CHI蛋白序列經跨膜和二級結構的預測,發(fā)現位于此段CHI的cDNA序列沒有明顯的跨膜結構,蛋白結構主要以螺旋和線狀結構為主。
　　 3.利用RT-PCR和RACE技術克隆龍眼葉片DHAR基因全長
　　 龍眼葉片DHAR基因cDNA全長為1038 bp(GenBank登錄號為JF718283),開放閱讀框為552 bp,編碼183個氨基酸,分子量20.5

6、84 kD,等電點5.29。將龍眼葉片DHAR全長經過BLAST軟件比對,該序列與毛果楊DHAR基因的同源性較高,為79％；其次與蘋果、甘藍、芥菜、擬南芥、馬鈴薯同源性也比較高,分別為78％、78％、78％、77％、77％；并對其氨基酸序列進行比對發(fā)現,龍眼葉片的DHAR蛋白與蘋果、水稻、毛果楊、玉米須、蓖麻、擬南芥同源性也比較高,均達99％。經保守區(qū)功能區(qū)的分析,推導出DHAR蛋白擁有兩個保守區(qū)域,GST C DHAR超級家族和GST