柔嫩艾美耳球蟲(chóng)抗藥性相關(guān)基因M20的克隆及檢測(cè)方法的建立.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是由寄生在雞腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的艾美耳球蟲(chóng)引起的一種寄生性原蟲(chóng)病,多危害15～50日齡的雛雞,死亡率很高,該病分布廣泛,危害極其嚴(yán)重,目前仍以藥物防治為主。由于長(zhǎng)期不規(guī)范地藥物使用,導(dǎo)致抗藥株的普遍產(chǎn)生。至今已從養(yǎng)雞場(chǎng)中分離出幾乎對(duì)所有使用過(guò)抗球蟲(chóng)藥具有抗藥性的蟲(chóng)株,且抗藥性產(chǎn)生的時(shí)間縮短、程度日趨嚴(yán)重,由單一的抗性變?yōu)槎嘀氐?、交叉的抗?抗藥性已經(jīng)成為球蟲(chóng)病防治中遇到的最嚴(yán)重的問(wèn)題,但其產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚。對(duì)控制某一特定藥物抗藥性

2、基因的檢測(cè),可以監(jiān)測(cè)抗藥性的蔓延并增加指導(dǎo)用藥策略的有效性。
　　 本研究室前期構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria tenella)地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株與各自母株之間的抑制性消減文庫(kù),利用RACE技術(shù)獲得了一些與抗藥性相關(guān)基因的全長(zhǎng)序列。本研究選擇其中的M20新基因進(jìn)行了克隆與原核表達(dá),建立了針對(duì)M20基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用于檢測(cè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的抗藥性,并用雞體藥物敏感試驗(yàn)對(duì)定量PCR結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

3、>　　 1.球蟲(chóng)抗藥性相關(guān)基因M20的克隆及表達(dá)
　　 根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增獲得了與抗藥性相關(guān)的新基因M20,其全長(zhǎng)cDNA序列為847 bp,包括一個(gè)525 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼174個(gè)氨基酸,理論分子量約為19 KDa。其編碼的蛋白與剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)的胰島素降解酶在31～477位氨基酸間具有45％的同源性。該基因在未孢子化卵囊階段的表達(dá)量最高,而在裂殖子階段和子孢子階段幾乎沒(méi)有表達(dá)

4、。將獲得的M20全長(zhǎng)cDNA連接到原核表達(dá)載體pET28b中,成功構(gòu)建了pET28b-M20的重組表達(dá)質(zhì)粒,并且利用大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)出該重組蛋白,但以包涵體形式存在。Western blot檢測(cè),該蛋白還具有一定的免疫原性。
　　 2.Real-Time PCR檢測(cè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)抗藥性方法的建立
　　 為建立簡(jiǎn)單、快速的球蟲(chóng)耐藥性檢測(cè)方法,根據(jù)M20基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,分別建立了SYBR Green

5、法和TaqMan Probe法的Real-Time PCR方法。結(jié)果顯示,兩種方法均具有良好的特異性和重復(fù)性。選擇操作簡(jiǎn)單、成本較低的SYBR Green法對(duì)已知具有抗性的地克珠利抗藥株、馬杜拉霉素抗藥株以及對(duì)藥物敏感的母株之間M20基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,敏感株的M20基因表達(dá)量明顯高于兩株抗藥株,地克珠利抗藥株次之,馬杜拉霉素抗藥株最少,說(shuō)明建立的定量PCR用于檢測(cè)球蟲(chóng)抗藥性是可行的。
　　 3.Real-Time

6、 PCR方法在檢測(cè)球蟲(chóng)田間株抗藥性中應(yīng)用
　　 采用單卵囊分離技術(shù)從雞球蟲(chóng)田間株混合種中進(jìn)行球蟲(chóng)純種的分離與鑒定,獲得了一株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)田間株。以地克珠利抗藥株、馬杜拉霉素抗藥株以及藥物敏感株為參照,采用建立的SYBR Green法Real-Time PCR,對(duì)所分離的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)田間株的M20基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,柔嫩艾美耳球蟲(chóng)田間株M20基因含量高于敏感株,而敏感株的含量高于地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株,說(shuō)

7、明所分離的田間株對(duì)藥物敏感。為了驗(yàn)證定量PCR結(jié)果,采用雞體試驗(yàn)對(duì)田間株的藥物敏感性進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,田間株對(duì)馬杜拉霉素、癸氧喹酯、地克珠利和鹽霉素均表現(xiàn)為敏感,結(jié)果與定量PCR的一致。
　　 綜上所述,本研究對(duì)抗藥性相關(guān)新基因M20進(jìn)行了克隆及表達(dá)；在以地克珠利抗藥株、馬杜拉霉素抗藥株以及藥物敏感株作為參照下,建立了以檢測(cè)M20基因?yàn)榘谢虻腟YBR Green Real-time PCR法,成功應(yīng)用于球蟲(chóng)抗藥性的檢測(cè)；通